一种犬乳腺癌细胞系及其建立方法和应用

本发明涉及一种动物细胞系，具体涉及一种犬乳腺癌细胞系及其建立方法和应用。

背景技术：

1、犬乳腺肿瘤(canine mammary tumor，cmt)是未绝育雌犬最常见的肿瘤疾病之一，研究表明犬肿瘤病例中50％以上为乳腺肿瘤，目前治疗犬乳腺肿瘤最主要手段为手术疗法和化学疗法。已公开的犬基因组序列相关研究表明，与啮齿类动物相比，狗和人类基因序列之间的相似性更大。在比较肿瘤学中，犬的许多肿瘤具有与人类癌症相似的临床病理学特征或发病率，犬乳腺肿瘤也不例外。犬乳腺肿瘤大多为自发性发展，免疫系统完整，和人乳腺肿瘤在流行病学、组织学和临床特征等方面都具有高度的相似性。因此，犬乳腺肿瘤也可作为人乳腺肿瘤研究其发病机制、药物开发以及免疫治疗的良好模型。

2、肿瘤细胞作为肿瘤研究的基础体外模型，在研究其分子机理和抗癌药物筛选中都发挥着至关重要的作用。对肿瘤细胞进行体外培养并建立肿瘤细胞系可用于研究肿瘤细胞的生物学特性和肿瘤的分子机理，尽管在过去几年中，已经开发出了几例犬乳腺肿瘤细胞系，但数量仍然十分有限，建立多个不同分子类型的犬乳腺肿瘤细胞系并对其免疫表型和致瘤性进行试验能够有助于进一步的体外研究。

技术实现思路

1、发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一株犬乳腺癌细胞系并成功荷瘤小鼠，为研究犬乳腺癌发病机制和药物筛选提供的良好体内体外模型。

2、技术方案：本发明所述的犬乳腺癌细胞系，命名为犬乳腺癌细胞系cmt-n7，已于2023年7月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2023224。

3、所述的犬乳腺癌细胞系，所述细胞系来源于12岁雌性贵宾犬乳腺肿瘤组织。

4、犬乳腺癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：

5、(1)获取犬乳腺肿瘤组织采用ii型胶原酶进行分解、过滤、收集细胞，重悬于完全培养基中并在细胞培养箱中培养；

6、(2)细胞长至80％～90％密度，pbs清洗2～3次，0.2-0.4％胰酶消化1-3min后离心，离心后的细胞进行1：2-3传代，每5-7代进行一次细胞冻存，体外传代超过50代后，进行生物学指标检测并验证。

7、所述的犬乳腺癌细胞系的构建方法，所述生物学指标检测包括细胞形态、生长曲线、染色体分析、迁移能力、免疫荧光特性、支原体检测、成瘤率、免疫组化特性。

8、所述的犬乳腺癌细胞系的构建方法，细胞形态在光学显微镜下普遍呈上皮样形态或纺锤形，细胞核大而不规则，出现多核仁现象；细胞形态在透射电镜显示其细胞核大且轮廓不规则；细胞生长曲线呈s形，倍增时间为19-21h。倍增时间优选为20.34h。

9、所述的犬乳腺癌细胞系的构建方法，细胞染色体数目在70至90之间，且不为犬正常细胞染色体数目78条。

10、所述的犬乳腺癌细胞系的构建方法，细胞表现出了较强的迁移能力；细胞相关分子标志物er、α-sma、ck-14、sox-2、vimentin、ki-67、e-cadherin、和cox-2表达呈阳性。

11、所述的犬乳腺癌细胞系在制备免疫缺陷动物乳腺癌模型中的应用。优选地，所述的犬乳腺癌细胞系在制备免疫缺陷小鼠乳腺癌模型中的应用。

12、所述的犬乳腺癌细胞系在制备荷瘤小鼠模型中的应用。

13、所述的应用，所述的犬乳腺癌细胞系在皮下接种小鼠中的用量为106个细胞。

14、优选的，所述犬乳腺癌细胞系能体外长期生长和稳定传代。

15、细胞皮下接种裸鼠中的用量为106个细胞。荷瘤小鼠肿瘤组织细胞异型性明显，有明显的核分裂。荷瘤小鼠肿瘤组织细胞her-2和pr表达均为阴性，er、ki-67、e-cadherin、vimentin、cox-2表达均为阳性。

16、进一步的，犬乳腺癌细胞呈上皮样形态或纺锤形，细胞的异型性明显，细胞核大而不规则，出现多核仁现象，倍增时间为20.34h，染色体数目在70至90之间，有较强的迁移和侵袭能力并同时表达上皮免疫标志物和间质免疫标记物，无支原体污染。

17、进一步的，所述犬乳腺癌细胞系致瘤率达100％。

18、进一步的，1×106个细胞注入裸鼠皮下，2周后可观测肿瘤的形成，在肿瘤表面观测到明显的血管生成。组织学检查肿瘤组织细胞异型性明显，核仁增加，并观察到明显的核分裂相。

19、生物材料的保藏：本发明所述的犬乳腺癌细胞系，命名为犬乳腺癌细胞系cmt-n7，已于2023年7月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no：c2023224。

20、有益效果：本研究所分离的犬乳腺肿瘤细胞为贴壁生长的上皮样细胞且呈多层生长，细胞间的接触抑制性降低且倍增时间较短(20.34h)，基本保持在每2～3天进行一次传代，说明该细胞的增殖能力较强，且本研究建立的细胞系经过冻存后复苏仍生长良好，可长期冷冻保存。目前该细胞系已经稳定传代超过120余代，生长超过一年。此外，该细胞系生物标记物vimentin和e-cadherin均呈阳性，可能正处于上皮-间质转化的过程中。利用此细胞系成功建立裸鼠荷瘤模型，接种成瘤率高达100％。因此，该细胞系可作为研究犬乳腺癌体内、体外试验研究，为肿瘤发生发展机制和药物筛选提供良好的体外试验模型。

技术特征：

1.犬乳腺癌细胞系，其特征在于，其为犬乳腺癌细胞系cmt-n7，保藏编号为cctcc no：c2023224。

2.根据权利要求1所述的犬乳腺癌细胞系，其特征在于，所述细胞系来源于12岁雌性贵宾犬乳腺肿瘤组织。

3.一种犬乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的犬乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述生物学指标检测包括细胞形态、生长曲线、染色体分析、迁移能力、免疫荧光特性、支原体检测、成瘤率、免疫组化特性。

5.根据权利要求4所述的犬乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，细胞形态在光学显微镜下普遍呈上皮样形态或纺锤形，细胞核大而不规则，出现多核仁现象；细胞形态在透射电镜显示其细胞核大且轮廓不规则；细胞生长曲线呈s形，倍增时间为19-21h。

6.根据权利要求4所述的犬乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，细胞染色体数目在70至90之间，且不为犬正常细胞染色体数目78条。

7.根据权利要求4所述的犬乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，细胞表现出了较强的迁移能力；细胞相关分子标志物er、a-sma、4k-14、sox-2、vimentin、ki-67、e-cadherin、和cox-2表达呈阳性。

8.权利要求1所述的犬乳腺癌细胞系在制备免疫缺陷动物乳腺癌模型中的应用。

9.权利要求1所述的犬乳腺癌细胞系在制备荷瘤小鼠模型中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的犬乳腺癌细胞系在皮下接种小鼠中的用量为106个细胞。

技术总结
本发明公开了一种犬乳腺癌细胞系及其建立方法和应用，该犬乳腺肿瘤细胞系CMT‑N7，保藏编号为CCTCC NO：C2023224，保藏日期为2023年7月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。本发明提供的细胞系细胞呈多层生长，细胞形态普遍呈上皮样形态或纺锤形，细胞的异型性明显，细胞核大而不规则且明显出现多核仁现象，贴壁牢固，染色体数目和结构畸变，细胞接种成瘤率为100％，是一个较理想可靠的研究模型，适用于犬乳腺癌的在体内、体外研究，具有重要的基础研究与临床应用价值。

技术研发人员：郭大伟,宋昕昊,胡诗恒,江善祥
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22