一种调控杨树生长量的油菜素内酯合成基因PtoCYP90D1及其应用

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种调控杨树生长量的油菜素内酯合成基因ptocyp90d1及其应用。

背景技术：

1、杨树，富含木质纤维素，且多年生，是大规模生物质能源林绿化的重要树种，杨树的基因操纵也相对容易，因此科学家把它作为种模式木本植物加以研究。不久前，杨树的基因组测序工作已经完成，科学家们计划在此基础上改造杨树，使之生长更迅速、树冠更小，还致力于培育出纤维素含量更高、木质素含量更低的新品种，从而降低纤维素乙醇的生产成本。

2、mitchell等(1970)从油菜(brassica napus l.)花粉的提取物中发现对植物的生长促进效应有别于其他激素的植物生长调节物质，故将此类新物质命名为油菜素(brs)(mitchell jw.et al.,1970)，brs与其它激素不同，br不能长距离运输，它们在合成位点附近行使作用(symons g m et al.,2003)。brs的内源水平因植物器官类型、组织年龄和物种而异，其中花粉和未成熟种子的含量最高，年轻的、生长的枝条比成熟组织含有更高的br水平(clouse,s d et al.,2002)。

3、目前通过遗传手段调节br含量从而改变植物代谢及其生物量已经被证明。liu等(2007)过表达br合成关键基因dwf4获得内源br升高的转基因拟南芥植株分枝数增加2倍以及种子产量增加一半多，同样过表达zmdwf4拟南芥植株分枝数株高显著增加(liu etal.2007)。拟南芥中异位过表达atdwarf4增加植株株高，单株种子产量增加59％(choe etal.,2001)。在拟南芥dwf4突变体中超表达玉米dwf4株高比野生型显著增加(liu et al.,2007)。棉花dwf4基因在番茄中表达，果实重量增加，并且成熟加速，果实蛋白质、维生素c及可溶性糖含量显著增加(ye et al.,2015)。

4、除了在草本植物中，木本植物调控br合成，可以达到改变植物生物量的生成。超表达br合成关键基因pagdet2促进转基因植株高生长(李泽华等，2020)，催化最后一步的酶ptcyp85a3基因的超表达可以明显促进转基因杨树cs含量的增加，同时明显增加植株株高、茎鲜重和叶片大小，另外还可以增强木质发育，增加木质部面积，促进杨树的木质发育从而使茎增粗、同时木质部中的细胞壁物质也明显增多，但是不影响次生细胞壁的增厚，表现为次生壁厚度及其中的纤维素和木质素的组分没有明显的变化(yan li jin et al.2017)。因此，br可以通过多种途径改良农作物，提高作物品质与产量。

5、据报道，atcyp90d1参与brs生物合成途径中多步的c-23羟基化反应(ohnishi,t.,et al.2006)，水稻中被克隆出来的与atcyp90d1同源的两个基因oscyp90d2/d3，参与brs合成的c-23羟基化，他们的突变体具有典型的br缺陷表型(sakamoto,t.,et al.2012；hui liet al.,2013)，另外，oscyp90d2可以参与c-3脱氢反应。cyp90d1可以参与brs合成多个反应，是合成通路中关键酶之一。

6、cyp90d1在拟南芥，水稻对植物影响研究已经比较清楚。但是，对于杨树ptocyp90d1基因能不能在植物体内过量表达以提高植物体内brs含量，并进而提高植株的生物量目前还没有报道。

7、基于此提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种调控杨树生长量的油菜素内酯合成基因ptocyp90d1及其应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种调控杨树生长量的油菜素内酯合成基因ptocyp90d1，所述油菜素内酯合成基因ptocyp90d1的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明还提供了编码所述油菜素内酯合成基因ptocyp90d1的氨基酸序列，所述氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、本发明还提供了一种引物对，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.3～4所示；

6、所述引物对用于扩增所述的油菜素内酯合成基因ptocyp90d1。

7、本发明还提供了所述的油菜素内酯合成基因ptocyp90d1在提高木本植物木材生物量中的用途。

8、本发明还提供了一种植物表达载体，所述植物表达载体包括所述的油菜素内酯合成基因ptocyp90d1、35s启动子和空载载体；

9、所述空载载体为psh737。

10、本发明还提供了所述的植物表达载体在提高木本植物木材生物量中的用途。

11、本发明还提供了一种重组菌，包括所述的植物表达载体和受体菌株；

12、所述受体菌株为：农杆菌lba4404。

13、本发明还提供了所述的重组菌在提高木本植物木材生物量中的用途。

14、本发明还提供了一种提高杨树木材生物量的育种方法，包括如下步骤：

15、(1)将杨树无菌苗叶片置于所述的重组菌的菌悬液中，浸泡6～10min，得到携带菌体的杨树外植体；

16、(2)将携带菌体的杨树外植体置于共培养培养基中，23～27℃培养40～56h，转接至诱导培养基中培养，得到抗性芽；

17、(3)切下抗性芽转接至生根培养基中，继续培养至不定根生长完全，得到转基因杨树苗；

18、所述共培养培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分：

19、ms4.0～5.0g/l、蔗糖28～32g/l、玉米素1.9～2.1mg/l、萘乙酸0.9～1.1mg/l、琼脂7.0～8.0g/l；

20、所述共培养培养基的ph为5.8～6.0；

21、所述诱导培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分：

22、ms4.0～5.0g/l、蔗糖28～32g/l、玉米素1.9～2.1mg/l、萘乙酸0.9～1.1mg/l、琼脂7.0～8.0g/l、特门汀190～210mg/l、卡那霉素95～105mg/l；

23、所述诱导培养基的ph为5.8～6.0；

24、所述生根培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分：

25、ms2.0～2.5g/l、蔗糖28～32g/l、萘乙酸0.09～0.11mg/l、琼脂5.5～6.5g/l、特门汀90～110mg/l、卡那霉素95～105mg/l；

26、所述生根培养基的ph为5.8～6.0。

27、本发明提供了一种调控杨树生长量的油菜素内酯合成基因ptocyp90d1及其应用。本发明的优点为：

28、本发明以毛白杨为材料，克隆了ptocyp90d1基因；同时鉴定了毛白杨不同组织ptocyp90d1基因表达量；构建过量表达载体psh373-35s-ptocyp90d1，该基因位于启动子35s之后，在启动子35s的驱动下，ptocyp90d1可在杨树体内高效表达，从而调控杨树的生物量；其中，ptocyp90d1基因是调控杨树生物量的关键基因。

29、本发明通过将ptocyp90d1基因转入杨树，过量表达ptocyp90d1的转基因杨树与野生型相比，明显增高、增粗，且木质部细胞数量明显增多，同时转基因干鲜重增加，木质素纤维素变化，说明ptocyp90d1基因是调控杨树生物量的关键调节基因，在林木基因工程领域和无性系林业领域有重要的应用价值。