快速鉴定芽叶早生茶树种质的InDel标记引物及其应用

本发明涉及芽叶早生茶树种质鉴定，具体涉及快速鉴定芽叶早生茶树种质的indel标记引物及其应用。

背景技术：

1、茶树(camelliasinensis(l.)o.kuntze)作为具有高附加值的经济作物，有着广阔的消费市场与极大的消费体量。作为多年生植物，大多数种植在温带地区的茶树在秋冬季芽会停止生长进入休眠状态，茶树春季萌芽期是茶树春茶产量的重要因子之一。同时早春茶由于有利于茶品质的物质积累较多、病虫害影响小等因素，是一年中具有最高价值的茶叶产品。茶树通过感知外界环境的温度与光照的长短来调控芽休眠的开始与结束，这一生理过程受到来自植物内部物质与外部环境的严格调控，并且存在高度的遗传性，在同一环境下发芽早和发芽晚的茶树品种春季萌芽期差异可达40天，因此具有春季芽早生性状的茶树品种具有相对更高的栽培价值。

2、基于系统选种进行的春季芽叶早生茶树品种选育依赖于多年的春季萌发期田间观测鉴定，但作为数量性状，田间的春季发芽期观测受环境因素影响大，且发芽期表型观测需2-3年生以上的植株，观测窗口期短，一年只能观测一次，需要连续观测多年才能得到较为准确的结果，因此程序复杂，需要投入大量人力物力。相比之下，基于与早生性状连锁的分子标记，进行分子标记辅助选择(molecularassistantselection，mas)可以不受环境、基因表达与否等的影响，对群体中含有目的性状的子代进行早期筛选，加快育种的进程。现阶段围绕茶树芽休眠与萌发的标记开发工作仍存在较大空白，仅有wang等基于‘云抗10号’和‘铁观音’等茶树材料开发的一个dcaps(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequences)标记。

3、插入/缺失(insertion-deletion，indel)是一类发生在近缘种或同一物种不同个体间的基因组同源序列对比空位现象，具体表现为基因组同一位点的不同大小核苷酸片段的插入/缺失。indel标记基于pcr扩增，本质上是比较不同基因组的同一片段的长度多态性标记。indel标记广泛存在于动植物基因组中，其数量仅次于snp(singlenucleotidepolymorphism)标记，而远高于ssr(simplesequencerepeated)等二代标记。同时由于indel标记是通过序列长短实现检测，因此相比于snp标记，indel标记简单快捷，利用电泳技术可以实现快速检测，此外indel标记还具有较好的通用性、稳定性，同时对dna质量要求较低。

4、在茶学领域，indel标记的开发利用报道较少，liu等曾利用‘舒茶早’和云抗10号’两个茶树品种进行全基因组比较分析，鉴定得到了数目众多的indel位点，并成功开发了48个具有较好多态性，可用于遗传研究的indel标记。在性状连锁标记方面，仅见于紫芽品种鉴别等少数报道，存在较为广阔的利用空间。

5、wangetal(2019)基于简化基因组测序技术(slaf-seq)及全基因组关联分析法(gwas)在茶树基因组中发现了一个与茶树芽叶萌芽期性状紧密连锁的snp标记位点(sc0002405-p269473)。对该snp位点等位变异分析后发现，“tt”基因型比“tc”、“cc”基因型平均萌芽期分别提早10天、12天，即该snp位点上的“tt”基因型是与茶树芽叶早生性状相关的有利基因型。基于上述发现，利用该snp标记附近的dna序列设计了一对dcaps标记引物，利用该引物对不同的茶树种质dna进行pcr扩增、电泳分离及基因型分析即可将芽叶早生茶树种质筛选出来，实现了芽叶早生茶树品种的分子标记辅助育种。

6、但是其存在以下缺陷：dcaps标记的关键在于利用限制性内切酶进行酶切消化，在该技术中需要利用ecori限制性内切酶进行消化，相比于ssr标记或者是indel标记成本和实验难度更高，同时酶切消化需要一个小时以上的时间，这一额外步骤使得整体实验耗时长且繁琐。

7、基于此，本发明设计了快速鉴定芽叶早生茶树种质的indel标记引物及其应用以解决上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术所存在的上述缺点，本发明提供了快速鉴定芽叶早生茶树种质的indel标记引物及其应用。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

3、快速鉴定芽叶早生茶树种质的indel标记引物，其序列如下：

4、上游引物序列：5’-gaaataggtccgtcctcac-3’；

5、下游引物序列：3’-ccactgcttctccaattactta-5’。

6、本发明还公开了一种所述的indel标记引物在快速鉴定芽叶早生茶树种质中的应用。

7、本发明还公开了一种所述的indel标记引物在对‘峨眉问春’ב川沐217’子代进行基因分型中的应用。

8、本发明还公开了一种所述的indel标记引物在对‘龙井43’ב白毫早’子代进行基因分型中的应用。

9、有益效果

10、一，利用本发明方法鉴定芽叶早生茶树种质的整个过程可在1个工作日内完成，耗时短，效率高，可以节约茶树种质鉴定过程中的人力、物力、财力；能够更好的应用于育种工作中去；

11、二，本发明鉴定芽叶早生茶树种质非常方便，只要茶树上有叶片等能进行dna提取的组织部位，任何时间均可鉴定，无需在春季茶芽萌发时进行鉴定；

12、三，本发明鉴定准确率高，在两个茶树分离群体中应用本发明进行基因型与多年的萌发数据进行差异显著性分析，显著性均达到p<0.01水平；

13、四、本发明可实现对早生种质资源的快速鉴定，不需要借助酶切消化等额外环节，降低实验的门槛，检测成本低；且品种间通用性好；

14、五、由于本发明是对茶树品种的dna分子标记基因型进行鉴定，因此无需在春季茶芽萌发季节进行鉴定，只要茶树上有叶片，任何时间均可鉴定；

15、六、本发明通过验证实验可看出，indel标记引物可有效用于‘峨眉问春’ב川沐217’、‘龙井43’ב白毫早’子代进行基因分型，并筛选出平均发芽更早的子代。

技术特征：

1.快速鉴定芽叶早生茶树种质的indel标记引物，其特征在于，其序列如下：

2.一种根据权利要求1所述的indel标记引物在快速鉴定芽叶早生茶树种质中的应用。

3.一种根据权利要求1所述的indel标记引物在对‘峨眉问春’ב川沐217’子代进行基因分型中的应用。

4.一种根据权利要求1所述的indel标记引物在对‘龙井43’ב白毫早’子代进行基因分型中的应用。

技术总结
本发明公开了快速鉴定芽叶早生茶树种质的InDel标记引物及应用，属于芽叶早生茶树种质鉴定技术领域，其序列如下：上游引物序列：5’‑GAAATAGGTCCGTCCTCAC‑3’；下游引物序列：3’‑CCACTGCTTCTCCAATTACTTA‑5’。利用本发明方法鉴定芽叶早生茶树种质的整个过程可在1个工作日内完成，耗时短，效率高，可以节约茶树种质鉴定过程中人力、物力、财力；二，本发明鉴定芽叶早生茶树种质非常方便，只需取茶苗上少量叶片或其他组织，能进行DNA提取，即可在任何时间鉴定，无需等茶树长大并在春季茶芽萌发时进行鉴定。

技术研发人员：谭礼强,毛润锦,崔懂,常开玲
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15