一种用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的DNA聚合酶突变体及其制备与应用

本发明涉及基因工程。具体而言，本发明涉及一种能够用于快速pcr和耐受复杂条件的dna聚合酶突变体及其制备与应用。

背景技术：

1、taq dna聚合酶是一种属于a家族的具有耐热特性的dna聚合酶，与1976年由chine等人从水生嗜热菌thermus aquaticus中分离而来。1988年saiki等人将taq dna聚合酶应用到pcr中实现pcr反应的自动化。全长的taq dna聚合酶由832个氨基酸组成，最适反应温度在75～80℃，95℃处理半个小时能够保留一半的活力。在70℃，taq dna聚合酶能够以60nt速率延伸dna链，在55℃时反应速率降为不到原来的一半。taq dna聚合酶是镁离子依赖聚合酶，最适镁离子浓度在2～4mm，而钠离子存在会抑制反应活性。

2、随着pcr技术的推广，研究人员对taq dna聚合酶的要求也日益严苛，在一些特定场景中传统的taq dna聚合酶已然不能满足研究人员的需求，如减少pcr反应时间，提高对抑制剂的抵抗。

技术实现思路

1、针对现有的一些技术问题，本发明提供一种能够用于快速pcr且具有抑制剂抵抗的taq dna聚合酶及其制备和应用。本发明的用于快速pcr且具有抑制剂抵抗的taq dna聚合酶延伸速度快，对常见的影响taq dna聚合酶活性的抑制剂抵抗性高，可用于减少时间的快速pcr以及在血清样本、氯化钠溶液样本中扩增目的基因。具体而言，本申请通过以下技术方案解决了本领域的技术问题。

2、1.一种taq dna聚合酶突变体，其与seq id no:3所示的野生型taq dna聚合酶相比，包含选自d655n、e681k、e742q和m747r组成的组的一个氨基酸取代或多个氨基酸取代的组合。

3、2.项目1所述的taq dna聚合酶突变体，其氨基酸序列如seq idno:1所示。

4、3.组合物，其包含项目1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体。

5、4.多核苷酸，其编码项目1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体，优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:2所示。

6、5.载体，其包含项目4所述的多核苷酸，优选地，所述载体为表达载体，更优选pet-22b。

7、6.宿主细胞，其包含项目1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体、项目4所述的多核苷酸或项目5所述的载体，所述宿主细胞优选为原核细胞，更优选大肠杆菌感受态细胞e.coil bl21。

8、7.试剂盒，其包含项目1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体或项目3所述的组合物和使用说明书。

9、8.一种pcr扩增方法，其包括使用项目1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体或项目3所述的组合物或项目7所述试剂盒进行pcr扩增。

10、9.一种制备项目1-2任一项所述的taq dna聚合酶突变体的方法，其包括培养项目6所述的宿主细胞并诱导表达taq dna聚合酶突变体，并分离出所述taq dna聚合酶突变体。

11、10.项目9所述的方法，其中所述taq dna聚合酶突变体的分离包括收集宿主细胞，破碎细胞，离心，收集上清液并用于亲和纯化，优选镍柱亲和纯化后进行肝素亲和纯化。

12、11.通过项目9-10任一项的方法制备的taq dna聚合酶突变体。

13、本发明的有益技术效果：

14、本发明的上述taq dna聚合酶突变体与野生型taq dna聚合酶具有更加快速的延伸速度，可用于减少时间的快速pcr场景。

15、本发明的taq dna聚合酶突变体具有更强的抵抗抑制剂的活性，可在含有氯化钠、血清样本中直接进行目的基因扩增。

16、本发明提供的所述taq nda聚合酶突变体的制备方法，可以制备出不含有内源性核酸，活性高，热稳定性好，抗干扰能力强的taq dna聚合酶。

技术特征：

1.一种taq dna聚合酶突变体，其与seq id no:3所示的野生型taq dna聚合酶相比，包含选自d655n、e681k、e742q和m747r组成的组的一个氨基酸取代或多个氨基酸取代的组合。

2.权利要求1所述的taq dna聚合酶突变体，其氨基酸序列如seq id no:1所示。

3.组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体。

4.多核苷酸，其编码权利要求1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体，优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:2所示。

5.载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸，优选地，所述载体为表达载体，更优选pet-22b。

6.宿主细胞，其包含权利要求1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体、权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体，所述宿主细胞优选为原核细胞，更优选大肠杆菌感受态细胞e.coil bl21。

7.试剂盒，其包含权利要求1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体或权利要求3所述的组合物和使用说明书。

8.一种pcr扩增方法，其包括使用权利要求1至2中任一项所述的taq dna聚合酶突变体或权利要求3所述的组合物或权利要求7所述试剂盒进行pcr扩增。

9.一种制备权利要求1-2任一项所述的taq dna聚合酶突变体的方法，其包括培养权利要求6所述的宿主细胞并诱导表达taq dna聚合酶突变体，并分离出所述taq dna聚合酶突变体。

10.权利要求9所述的方法，其中所述taq dna聚合酶突变体的分离包括收集宿主细胞，破碎细胞，离心，收集上清液并用于亲和纯化，优选镍柱亲和纯化后进行肝素亲和纯化。

11.通过权利要求9-10任一项的方法制备的taq dna聚合酶突变体。

技术总结
本申请公开了一种Taq DNA聚合酶突变体，其与SEQ ID No:3所示的野生型Taq DNA聚合酶相比，包含选自D655N、E681K、E742Q和M747R组成的组的一个氨基酸取代或多个氨基酸取代的组合。更具体地，所述Taq DNA聚合酶突变体氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。所述Taq DNA聚合酶突变可用于快速PCR且具有抑制剂抵抗，其延伸速度快，对常见的影响Taq DNA聚合酶活性的抑制剂抵抗性高，可用于减少时间的快速PCR以及在血清样本、氯化钠溶液样本中扩增目的基因。本申请还公开了其制备与应用。

技术研发人员：龚为民,温重政
受保护的技术使用者：中国科学技术大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15