一种基于数字PCR定量检测齿兰环斑病毒的方法与流程

本发明涉及微生物检测，具体地说，涉及一种齿兰环斑病毒的检测方法。

背景技术：

1、齿兰环斑病又称尖兰环斑病。在我国的福州、成都、上海基地均有分布，引起齿兰环斑病的病原为齿兰环斑病毒odontolossumringspoevims,orsv。此病毒感染植株后，在建兰上产生花叶状，在卡特兰上产生坏死斑，在龄兰上形成环斑。该病毒传播的主要途径是汁液、园艺操作过程和工具。对植物构成极大危害。

2、现有技术中对齿兰环斑病毒的检测方法，主要是基于血清学和分子生物学特征进行的，然而该检测方法存在诸多缺陷。

3、数字pcr(也可称单分子pcr)一般包括两部分内容，即pcr扩增和荧光信号分析。在pcr扩增阶段，与传统技术不同，数字pcr一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几万个单元中进行反应。不同于qpcr对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字pcr技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。数字pcr的定量方法不依赖于扩增曲线的循环阈值，因此不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，实现绝对定量分析。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，将数字pcr应用到齿兰环斑病毒的检测中，提供一种不需要内参以及标准品，可以定量检测齿兰环斑病毒的数字pcr定量检测方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种基于数字pcr定量检测齿兰环斑病毒的方法，包括如下步骤：

4、步骤一：待检样品前处理；

5、步骤二：配置反应液：包括ddpcr supermix for probes、上下游引物、探针、模板和ddh2o；

6、所述上下游引物为orsv-f1/orsv-r1：

7、orsv-f1 5'atcaacctttgtaccaattctctg 3'

8、orsv-r1 5'cagggaacctactggtcaaag 3'

9、所述探针为orsv-p1:

10、orsv-p1 aacacaacaagctc 5’fam 3’mgb；

11、步骤三：制备微滴：

12、(1)将一个新的dg8 cartridge放入holder中；

13、(2)将反应液加入到dg8 cartridge中间一排的8个孔中；

14、(3)在dg8 cartridge最底下一排8个孔中各加入微滴生成油(dg oil)，同样不能有空着的孔；

15、(4)盖上胶垫；

16、(5)将以上holder轻轻地平稳放置于qx200微滴生成仪中，生成微滴；

17、(6)微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴转移到96孔板中，结束后将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜得到反应板；

18、步骤四：pcr扩增：

19、将反应板放入伯乐pcr仪中进行扩增。

20、步骤五：检测微滴，pcr反应后，将样本板在电脑上设置成功后，放入qx200droplet微滴分析仪中，进行微滴分析检测，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。

21、作为优选的，在上述的基于数字pcr定量检测齿兰环斑病毒的方法中，步骤四所述扩增反应程序为：

22、预变性：温度95℃，10min，1个循环；

23、变性：温度94℃，30s，退火/延伸；温度60℃，60s，共40个循环；

24、结束反应：温度98℃，10min，1个循环；保存，温度4℃。

25、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

26、本发明不需要建立标准曲线，可以进行绝对定量；对orsv的pcr反应分成了数万个独立的pcr反应，既能够精确地检测到单拷贝甚至是低浓度混杂样品，又可以显著降低体系间的影响以及背景序列和抑制物对反应的干扰。

技术特征：

1.一种基于数字pcr定量检测齿兰环斑病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：

2.如权利要求1所述基于数字pcr定量检测齿兰环斑病毒的方法，其特征在于，步骤四所述扩增反应程序为：

技术总结
本发明公开了一种基于数字PCR定量检测齿兰环斑病毒的方法，包括如下步骤：步骤一：待检样品前处理；步骤二：配置反应液：包括ddPCR Supermix for Probes、上下游引物、探针、模板和ddH<subgt;2</subgt;O；所述上下游引物和探针；步骤三：制备微滴；步骤四：PCR扩增，将反应板放入伯乐PCR仪中进行扩增。步骤五：检测微滴，PCR反应后，将样本板在电脑上设置成功后，放入QX200Droplet微滴分析仪中，进行微滴分析检测，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。本发明不需要建立标准曲线，可以进行绝对定量；对ORSV的PCR反应分成了数万个独立的PCR反应，既能够精确地检测到单拷贝甚至是低浓度混杂样品，又可以显著降低体系间的影响以及背景序列和抑制物对反应的干扰。

技术研发人员：徐匆,郑芝波,黄皓,黄晓彦,李昀哲,陈彦,罗华建,胡珊,梁卫驱
受保护的技术使用者：东莞市农业科学研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15