一种表达融合蛋白的芽孢及其在群体感应抑制中的应用

本发明涉及农业及环境，尤其涉及一种表达融合蛋白的芽孢及其在群体感应抑制中的应用。

背景技术：

1、群体感应（quorum sensing，qs）是细菌通过分泌信号分子（如n-酰基高丝氨酸内酯类化合物（n-acyl homoserine lactone，ahls））调控相关基因表达从而适应环境的一种信号交流机制，细菌使用群体感应来调节它们的生长、发育和代谢等多种生理活动，包括毒力因子合成、生物被膜、质粒的结合转移、抗生素的合成等行为。其危害如下：一些细菌如烟草青枯病菌，会利用群体感应产生黏附于植物表面的生物被膜，阻碍植物的光合作用和呼吸作用，从而导致植物生长缓慢或死亡；同时，还有一些细菌如铜绿假单胞菌，利用群体感应来释放外毒素，可以破坏植物细胞的细胞膜和细胞壁，导致组织坏死和死亡。

2、由于传统的抗菌化合物（如抗生素）是通过干扰细菌的必需功能来杀死或抑制细菌，会导致抗生素耐药细菌的产生和传播，因此需要不断开发新的抗菌药物以抑制抗性菌株。而群体感应抑制剂可以抑制qs，具有高度特异性且不会引发细菌的耐药性增强，例如ahl-内酯酶 (aiia) 是一种由蜡样芽孢杆菌等芽孢菌产生的金属-β-内酰胺酶，可特异性水解革兰氏阴性菌分泌的ahl以抑制微生物的qs，从而消除或减轻病原体引起的症状。

3、枯草芽孢杆菌作为一种在自然界中广泛存在的细菌，具有多种优点，例如可以作为生物杀虫剂，产生溶菌酶等物质以防治害虫；也可以作为生物除草剂，产生杀草酮等防治多种草本植物；还具备固氮和磷酸化的功能，用以制备生物肥料，提高土壤肥力和作物产量。而芽孢是枯草芽孢杆菌在营养缺乏条件下形成的休眠体，可以在极端的环境条件下生存，因此可以在自然界中长期存活和繁殖。

技术实现思路

1、本发明提供一种表达融合蛋白的芽孢及其在群体感应抑制中的应用。本发明利用枯草芽孢杆菌的芽孢外壳蛋白 cotg基因连接柔性接头蛋白（linker）与ahl-内酯酶蛋白 aiia基因，能够在芽孢外壳表面表达aiia蛋白。

2、为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一种表达融合蛋白的芽孢，所述融合蛋白的编码基因由 aiia与 cotg基因间添加 linker基因构成；所述芽孢在芽孢外壳表面表达aiia蛋白。

3、本发明所提供的表达融合蛋白的芽孢中，所述 linker基因的序列如seq id no.1所示。

4、本发明所提供的芽孢为枯草芽孢杆菌的芽孢。

5、第二方面，本发明提供表达融合蛋白的芽孢的构建方法，基于gibson assembly技术对线性dna片段进行组装，同源重组至野生型枯草芽孢杆菌中；所述线性dna片段按照3‘-5‘的顺序，由 cotg基因片段、 linker基因片段、 aiia基因片段、 spec抗生素片段和 cotgds片段组成，所述 cotgds片段为 cotg基因下游0.8-1.2kb序列。

6、本发明发现， cotgds片段的选择是非常重要的，选择不同的 cotgds片段进行组装后，构建成功率显著不同。

7、在本发明所提供的构建方法中，扩增所述 cotg基因片段的引物对如seq id no.4-5所示；扩增所述 linker基因片段的引物对如seq id no.8-9所示；扩增所述 aiia基因片段的引物对如seq id no.2-3所示；扩增所述 spec抗生素片段的引物对如seq id no.10-11所示；扩增所述 cotgds片段的引物对如seq id no.6-7所示。

8、在本发明所提供的构建方法中，所述seq id no.2的前25bp为 cotg基因片段末端同源序列；所述seq id no.3的前21bp为 spec抗生素片段首端同源序列；所述seq id no.6的前18bp为 spec抗生素片段末端同源序列。

9、第三方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌由上述构建方法构建得到，所述枯草芽孢杆菌的芽孢在芽孢外壳表面表达aiia蛋白。

10、第四方面，本发明提供上述芽孢或上述枯草芽孢杆菌在制备群体感应抑制剂中的应用。

11、第五方面，本发明提供一种群体感应抑制剂，含有上述芽孢或上述枯草芽孢杆菌。

12、第六方面，本发明提供上述芽孢或上述枯草芽孢杆菌或上述的群体感应抑制剂在制备生物肥料中的应用。

13、以及，上述芽孢或上述枯草芽孢杆菌或上述的群体感应抑制剂在制备生物防治剂中的应用。

14、本发明的有益效果在于：

15、（1）现有技术中，制备细菌群体感应抑制剂需要高度专业的技能和设备，并且生产成本较高。本发明通过将ahl-内酯酶连接于芽孢外壳蛋白上，实现对细菌群体感应信号分子的猝灭，将cotg-linker-aiia菌株培养为cotg-linker-aiia芽孢后即可发挥效果，相较于传统的制备方法，成本较低且操作简单。

16、（2）本发明中，ahl-内酯酶连接在芽孢外壳蛋白上能够稳定存在，芽孢起到固定ahl-内酯酶的作用，通过离心的方法将表达ahl-内酯酶的芽孢收集后可以重复利用，可以节约使用成本。

17、（3）本发明在aiia蛋白与cotg外壳蛋白之间添加了linker柔性接头蛋白，使ahl-内酯酶有效发挥作用。

18、（4）本发明所提供的表达外源基因后的枯草芽孢杆菌的芽孢不仅可以干扰对植物有害的细菌群体感应，还具备生物防治和生产生物肥料等优点，可以用于农业和环境等领域，在未来具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种表达融合蛋白的芽孢，其特征在于，所述融合蛋白的编码基因包括aiia基因、cotg基因和linker基因，所述linker基因连接aiia基因和cotg基因；所述芽孢在芽孢外壳表面表达aiia蛋白。

2.根据权利要求1所述的芽孢，其特征在于，所述linker基因的序列如seq id no.1所示。

3.权利要求1-2任一项所述芽孢的构建方法，其特征在于，基于gibson assembly技术对线性dna片段进行组装，同源重组至野生型枯草芽孢杆菌中；所述线性dna片段按照3‘-5‘的顺序，由cotg基因片段、linker基因片段、aiia基因片段、spec抗生素片段和cotg ds片段组成，所述cotg ds片段为cotg基因下游0.8-1.2kb序列。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，

6.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌由权利要求3-5任一项所述构建方法构建得到，所述枯草芽孢杆菌的芽孢在芽孢外壳表面表达aiia蛋白。

7.权利要求1-2任一项所述的芽孢或权利要求6所述的枯草芽孢杆菌在制备群体感应抑制剂中的应用。

8.一种群体感应抑制剂，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述的芽孢或权利要求6所述的枯草芽孢杆菌。

9.权利要求1-2任一项所述的芽孢或权利要求6所述的枯草芽孢杆菌或权利要求8所述的群体感应抑制剂在制备生物肥料中的应用。

10.权利要求1-2任一项所述的芽孢或权利要求6所述的枯草芽孢杆菌或权利要求8所述的群体感应抑制剂在制备生物防治剂中的应用。

技术总结
本发明涉及农业及环境技术领域，具体提供一种表达融合蛋白的芽孢及其在群体感应抑制中的应用。本发明利用枯草芽孢杆菌的芽孢外壳蛋白cotG基因连接柔性接头蛋白（linker）与AHL‑内酯酶蛋白aiiA基因，获得能够在芽孢外壳表面表达AiiA蛋白的菌株CotG‑linker‑AiiA，与未连接linker接头蛋白的芽孢和野生型芽孢相比，CotG‑linker‑AiiA芽孢可以对50μg/mL的C4和2μg/mL的C6两种短链AHLs信号分子实现明显的猝灭效果，且可以回收后重复利用。

技术研发人员：饶雷,张天宇,桂萌,廖小军,杨东
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15