本发明属于生物制药，具体涉及一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺。
背景技术：
1、猪去氧胆酸(hyodesoxycholicacid，hdca)是以结合型广泛存在于动物胆汁中的一种生化物质，含量为1％-3％，化学名称为3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸，在乙醇中易溶，丙酮中微溶，在乙酸乙酯、氯仿或乙醚中极微溶解，在水中几乎不溶。hdca具有降血脂、镇痉和祛痰的作用，在临床上用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化症、气管炎、小儿病毒性呼吸道炎症，以及由肝胆疾病引起的消化不良，对百日咳菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌等有一定的抑制作用，作为清开灵注射剂中的有效成分，经临床观察，对急性白血病的治疗有良好作用，体外实验证明hdca具有诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖分裂的作用。
2、关于猪去氧胆酸的提取，一般以猪胆汁或加热提取胆红素后的猪胆汁为原料，如中国专利cn101037463a公开了一种从猪胆汁中制备高纯度猪去氧胆酸的方法，首先利用氢氧化钠或氢氧化钾对原料进行皂化处理，用强碱皂化将结合型的全部变为游离型猪去氧胆酸，通过盐析得到粗品，再对粗品脱色、纯化得到成品，但是皂化处理时间较长，一般需要24h，且温度需要保持在102～104℃，能耗较大，生产成本较高。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，采用生物法提取猪去氧胆酸，解决现有猪去氧胆酸制备工艺耗时长、能耗高、生产成本高的问题。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
3、一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，包括以下步骤：
4、s1、基因工程菌高密度发酵
5、将大肠杆菌在lb培养基上37℃活化4～6h，之后转移到摇瓶中，当od＝10～20时，转移至装有cd培养基的发酵罐内，补糖，补碱，控制体系ph为7.0～8.0，当od＝60～70时，加入诱导剂至终浓度为0.5mm，诱导反应20～24h，当od＝180～200，停止发酵，放出菌液，即得大肠杆菌菌液，于-20℃保存备用；
6、s2、全细胞水解
7、将提取过胆红素的猪胆汁加热至70～80℃，用稀硫酸调节ph为6.0～7.0得到待处理物质a，将待处理物质a降温到40～45℃，加入s1制备的大肠杆菌菌液，保温搅拌反应3～4h得到待处理物质b，取样，经过hplc检测产物中猪去氧胆酸的浓度，计算转化率；
8、s3、灭菌脱色
9、将s2制备的待处理物质b用氢氧化钠溶液调节ph至12～13，加热回流2h，得到待处理物质c，将待处理物质c降温至40～50℃，加入双氧水反应8-12h，所得产物呈淡黄色，板框过滤去除杂质，收集滤液得到待处理物质d；
10、s4、成镁盐
11、将s3制备的待处理物质d加热至70～80℃，用稀硫酸调节ph为9.0～9.5，之后降温至40～50℃，加入酯类溶剂，取样，经过hplc检测猪去氧胆酸的浓度，并计算体系中猪去氧胆酸的质量，加入硫酸镁溶液，搅拌反应4～6h，之后降温至室温，压滤，得到猪去氧胆酸镁盐；
12、s5、脱镁
13、向s4制备的猪去氧胆酸镁盐中加入其质量2倍的去离子水、酯类溶剂，用稀硫酸调节ph为3～4，静置分层，分离去除去水层，再加入去离子水调节ph为6.8～7.3，静置分层，分离去除去水层，剩余物浓缩至出现白色颗粒停止浓缩，降温至15～25℃后结晶析出结晶物，将结晶物离心，固体为猪去氧胆酸的湿品，50～60℃干燥2～4h，调整温度85～95℃，干燥4～6h，得猪去氧胆酸成品。
14、进一步地，s1中诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷。
15、进一步地，s2中大肠杆菌菌液加入量为待处理物质a质量的8‰。
16、进一步地，s3中双氧水的体积分数为20％～30％，双氧水加入量为待处理物质c质量的5％-8％。
17、进一步地，s2、s4、s5中稀硫酸质量分数为10-30％。
18、进一步地，s4中酯类溶剂加入量为待处理物质d质量的3-5％，硫酸镁与猪去氧胆酸的摩尔比为1：1，硫酸镁溶液由硫酸镁和去离子水按照质量比1：2组成。
19、进一步地，s5中酯类溶剂为猪去氧胆酸镁盐质量的5-8倍。
20、进一步地，s4、s5中酯类溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。
21、本发明的有益效果：
22、本发明提供一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，利用生物法代替传统的皂化法，采用培养过的大肠杆菌将提取过胆红素的猪胆汁中结合型牛黄猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺猪胆酸、甘安猪去氧胆酸、甘安鹅去氧胆酸、甘安胆酸和甘安猪胆酸水解为游离型猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸和猪胆酸，其中猪去氧胆酸的转化率为100％，猪去氧胆酸得率高，且代替传统皂化工艺中强碱(10-15％的氢氧化钠)的使用，从传统皂化工艺的24h缩短为4h，有效缩短工艺时间，从传统皂化温度102-104℃，降至40-45℃，有效节约能耗，且所得猪去氧胆酸成品熔点≥198℃，hplc检测猪去氧胆酸含量≥98％。
1.一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，大肠杆菌菌液加入量为待处理物质a质量的8‰。
3.根据权利要求1所述的一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，大肠杆菌菌液通过以下步骤制成：
4.根据权利要求3所述的一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷。
5.根据权利要求1所述的一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，s2具体包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，双氧水的体积分数为20％～30％，双氧水加入量为待处理物质c质量的5％-8％。
7.根据权利要求1所述的一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，s3具体包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，硫酸镁与猪去氧胆酸的摩尔比为1：1，硫酸镁溶液由硫酸镁和去离子水按照质量比1：2组成。
9.根据权利要求1所述的一种生物法制备高熔点猪去氧胆酸的工艺，其特征在于，s4具体包括以下步骤：