阿洛酮糖生物传感器及其构建方法与应用与流程

本发明涉及生物传感器，特别涉及阿洛酮糖生物传感器及其构建方法与应用。

背景技术：

1、d-阿洛酮糖是一种天然且稀有的单酮糖，与葡萄糖和果糖等常见单糖具有相同的实验式。阿洛酮糖是果糖的差向异构体，早在1915年被称为d-假果糖，德国化学家在1935年确定了它的结构，并将其更名为d-psicose。

2、d-阿洛酮糖具有低热量、甜度高、安全性好和稳定性好等优点。d-阿洛酮糖的甜度是蔗糖(食糖)的70％，但它只有营养能量(卡路里)值的10％。d-阿洛酮糖具有调节血糖等有益人体健康的特殊功能，被美国食品导航网评价为最具潜力的蔗糖替代品。近年来，d-阿洛酮糖正在以飞跃式的速度成为美国食品饮料npd的首选甜味剂之一。而相关行业内也预测阿洛酮糖将成为甜菊糖、赤藓糖醇之后的下一个热门天然甜味剂。

3、目前，d-阿洛酮糖主要是利用酶固定转化法或者全细胞催化法进行制备。其中使用的关键酶为d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(dpease)，其介导d-果糖到d-阿洛酮糖的催化，因此具有重要的市场应用价值。但是目前并没有合适的阿洛酮糖生物传感器，能够实现制备过程中的实时监测，从而为阿洛酮糖的制备和高活性dpease的筛选带来了一定的困难。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供阿洛酮糖生物传感器及其构建方法与应用。该阿洛酮糖生物传感器能够有效用于高浓度(大于等于0.1g/l)阿洛酮糖的定量检测，克服了传统传感器受制于高浓度阿洛酮糖检测灵敏度低的问题，从而能够真正用于阿洛酮糖的实际检测环境中，为阿洛酮糖的检测以及高活性dpease的筛选提供了有效的技术支持。

2、本发明的第一个方面，提供一种阿洛酮糖生物传感质粒，所述阿洛酮糖生物传感质粒包括依次连接的阿洛酮糖操纵子、阻遏蛋白和荧光蛋白。

3、在本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白gfp、rfp、yfp、bfp、dsred、mcherry中的一种或多种组成的串联体。

4、在本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白为gfp。

5、在本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白连接有降解标签，且所述降解标签能够降低荧光蛋白的荧光背景。

6、在本发明的一些实施方式中，所述降解标签连接于荧光蛋白的c端。

7、在本发明的一些实施方式中，所述降解标签包括ssra标签。

8、在本发明的一些实施方式中，所述阿洛酮糖操纵子的核苷酸序列如seq id no:1所示。

9、在本发明的一些实施方式中，所述阻遏蛋白包括psir。

10、在本发明中，术语阻遏蛋白(或称阻遏子)，调节基因编码的一种蛋白质，能与dna的特异位点结合，阻止na聚合酶对启动子的结合。在原核生物细胞中，阻遏蛋白结合的dna顺序称为操纵基因(如本发明中的阿洛酮糖操纵子)。

11、在本发明的一些实施方式中，所述阻遏蛋白psir的氨基酸序列如seq id no:2所示，对应的核苷酸序列如seq id no:3所示。

12、在本发明中，阿洛酮糖操纵子和阻遏蛋白psir组合调控绿色荧光蛋白gfp的表达，然后利用外源的大肠杆菌靶向蛋白降解系统clpxp蛋白酶与内源的ssra标签来调控gfp的诱导表达速度。由此，只有当细胞内存在高浓度的d-阿洛酮糖时，诱导表达的gfp速度才能高于clpxp蛋白酶的降解速度，从而在细胞内积累gfp，从而实现在高浓度范围内的灵敏响应。

13、本发明的第二个方面，提供含有本发明第一个方面所述阿洛酮糖生物传感质粒的转化子，所述转化子包括细胞和微生物。

14、在本发明的一些实施方式中，所述微生物包括细菌和真菌。

15、本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述阿洛酮糖生物传感质粒在制备阿洛酮糖检测产品中的应用。

16、在本发明的一些实施方式中，所述阿洛酮糖或其衍生物检测产品用于检测阿洛酮糖浓度大于等于0.1g/l的样品。

17、在本发明中，所述阿洛酮糖或其衍生物检测产品主要针对高浓度阿洛酮糖体系进行检测，而现有技术中的阿洛酮糖传感器无法对高浓度阿洛酮糖的浓度变化产生差异性响应，从而使其不能有效用于高浓度阿洛酮糖的检测。

18、本发明的第四个方面，提供一种阿洛酮糖检测产品，所述阿洛酮糖检测产品包括本发明第二个方面所述的转化子和含有、表达或分泌降解标签对应的蛋白酶或其突变体的产品。

19、在本发明的一些实施方式中，所述含有、表达或分泌降解标签对应的蛋白酶或其突变体的产品用于产生降解标签对应的蛋白酶或其突变体。

20、在本发明的一些实施方式中，所述突变体具有与降解标签对应的蛋白酶相同的降解标签降解效果。

21、在本发明的一些实施方式中，所述含有、表达或分泌降解标签对应的蛋白酶或其突变体的产品包括：降解标签对应的蛋白酶或其突变体和其表达载体。

22、在本发明的一些实施方式中，所述含有、表达或分泌降解标签对应的蛋白酶或其突变体的产品为：含有降解标签对应的蛋白酶基因的表达载体。

23、本发明的第五个方面，提供一种阿洛酮糖的检测方法，包括如下步骤：

24、将本发明第二个方面所述的转化子置于待检测体系中，在体系中加入或向转化子中转入降解标签对应的蛋白酶或其突变体或其表达载体，根据荧光强度变化和标准曲线，定性待检测体系中是否存在阿洛酮糖或定量体系中的阿洛酮糖。

25、在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶或其突变体为clpxp蛋白酶或保有降解标签降解能力的clpxp蛋白酶突变体。

26、本发明的有益效果是：

27、本发明提供了一种高浓度阿洛酮糖生物传感器，其能够有效用于高浓度(大于等于0.1g/l)阿洛酮糖的定量检测，克服了传统传感器受制于高浓度阿洛酮糖检测灵敏度低的问题，从而能够真正用于阿洛酮糖的实际检测环境中，为阿洛酮糖的检测以及高活性dpease的筛选提供了有效的技术支持。

技术特征：

1.一种阿洛酮糖生物传感质粒，其特征在于，所述阿洛酮糖生物传感质粒包括依次连接的阿洛酮糖操纵子、阻遏蛋白和荧光蛋白。

2.根据权利要求1所述的阿洛酮糖生物传感质粒，其特征在于，所述荧光蛋白连接有降解标签，且所述降解标签能够降低荧光蛋白的荧光背景。

3.根据权利要求1所述的阿洛酮糖生物传感质粒，其特征在于，所述降解标签包括ssra标签。

4.含有权利要求1～3任一项所述阿洛酮糖生物传感质粒的转化子，所述转化子包括细胞和微生物。

5.权利要求1～3任一项所述阿洛酮糖生物传感质粒在制备阿洛酮糖检测产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述阿洛酮糖检测产品用于检测阿洛酮糖浓度大于等于0.1g/l的样品。

7.一种阿洛酮糖检测产品，其特征在于，所述阿洛酮糖检测产品包括权利要求4所述的转化子和含有、表达或分泌降解标签对应的蛋白酶或其突变体的产品。

8.根据权利要求7所述的阿洛酮糖检测产品，其特征在于，所述含有、表达或分泌降解标签对应的蛋白酶或其突变体的产品包括：降解标签对应的蛋白酶或其突变体和其表达载体。

9.一种阿洛酮糖或其衍生物的检测方法，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶或其突变体为clpxp蛋白酶或保有降解标签降解能力的clpxp蛋白酶突变体。

技术总结
本发明公开了阿洛酮糖生物传感器及其构建方法与应用。本发明中的阿洛酮糖生物传感器包括依次连接的阿洛酮糖操纵子、阻遏蛋白和荧光蛋白，其能够有效用于高浓度(大于等于0.1g/L)阿洛酮糖的定量检测，克服了传统传感器受制于高浓度阿洛酮糖检测灵敏度低的问题，从而能够真正用于阿洛酮糖的实际检测环境中，为阿洛酮糖的检测以及高活性DPEase的筛选提供了有效的技术支持。

技术研发人员：赖诗静,张志乾,江翱,谭洪群,吴奕瑞,刘丽花,陈西朋,吴嵩,何茜,何景涛
受保护的技术使用者：态创生物科技（广州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15