用于检测膀胱癌的组合物及其用途的制作方法

本技术属于分子生物学领域，涉及基因检测，具体的是涉及一种用于检测膀胱癌相关基因甲基化的核酸组合物及其相应的试剂盒和用途。

背景技术：

1、膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。世界范围内，膀胱癌发病率位居恶性肿瘤的第9位，男性恶性肿瘤的第7位(9.5/10万)，女性为10位以后(2.410/10万)；死亡率居恶性肿瘤的第13位，男性死亡率为(3.2/10万)，女性为(0.9/10万)。膀胱癌存在地域、种族及性别的差异。各年龄段均可发病，高发年龄50～70岁，男性发病率为女性的3～4倍。相同分期的膀胱癌患者，男性预后优于女性患者。膀胱癌是严重威胁人民健康的恶性肿瘤之一，早期膀胱癌患者如果能得到及时诊断，可以增加手术保留膀胱的机会，提高患者生活质量和总体生存率。

2、目前临床上应用于膀胱癌筛查和诊断的手段主要包括尿细胞学检查，肿瘤标记物检查以及影像学检查(包括超声检查、ct及ct尿路造影(computedtomogr aphy urography，ctu)、mri及磁共振尿路成像(magnetic resonance urography，mru)、静脉尿路造影(intravenousurography，ivu)、胸部x线摄片或胸部ct等)。其中，尿脱落细胞学检查的敏感性为13％～75％，特异性为85％～100％。其敏感性与肿瘤分级呈正相关，高级别肿瘤(包括原位癌)阳性率达84％；g1和低级别肿瘤的敏感性为16％。另外，因尿液肿瘤标志物检测的敏感性高但特异性较低，临床上尚未广泛应用。目前膀胱镜检查和活检是诊断膀胱癌最可靠的方法。但这种有创筛查有可能引起泌尿男生殖系统感染、尿道及膀胱出血、尿道损伤和尿道狭窄等并发症。因此目前我们急需要找到一种无创且准确率较高的筛查手段。

3、液体活检技术是以血液、唾液、尿液等体液为检材，以肿瘤标志物等为检测指标，实现对癌症的早筛早诊，辅助分期，预后和复发监测，用药指导等，具有无创、高效、准确等优点。其中，以dna甲基化水平的异常变化作为肿瘤分子诊断的标志物是目前的研究热点之一，并逐渐成为科学界和医学界的共识。

技术实现思路

1、基于此，针对现有膀胱癌检测技术存在的问题，本技术提供了一种用于检测膀胱癌的组合物，本技术提供的组合物能够灵敏和特异地检测膀胱癌，本技术还提供了包含所述组合物的试剂盒以及其在检测膀胱癌中的用途。本技术提供的试剂盒具有良好的膀胱癌检测灵敏性，能够方便、快捷、有效地检测膀胱癌。

2、本技术提供了一种用于体外检测膀胱癌的组合物、试剂盒及其用途，以及基于该试剂盒来执行检测的方法，以及用于检测膀胱癌。

3、具体的，本技术采用如下技术方案，

4、1.一种用于体外检测膀胱癌的组合物，所述组合物包括：

5、用于检测目标基因甲基化状态的核酸，

6、其中，所述目标基因甲基化状态由所述目标基因的靶序列的甲基化来表征，

7、其中，所述目标基因为gata2基因。

8、2.根据项1所述的组合物，其中，所述gata2基因的靶序列为如seq id nos:1-4中任一项所示的序列或包含seq id nos:1-4中任一项所示的序列。

9、3.根据项1-2中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：

10、引物，所述引物为所述目标基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，

11、所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列；

12、优选地，所述至少9个核苷酸的片段，其为如seq id no:5和seq id no:6所示的序列，

13、优选地，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：

14、探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因的靶序列中的至少15个核苷酸的片段，

15、所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列；

16、优选地，所述至少15个核苷酸的片段，其为如seq id no:7所述的序列；

17、优选地，其还包括：

18、将目标基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。

19、4.一种用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸，其包括：

20、seq id no:1或seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段。

21、5.根据项4所述的寡核苷酸，其还包括：

22、在中等严紧或严紧条件下杂交于所述seq id no:1或seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段。

23、6.一种用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸，其包括：

24、seq id no:5和seq id no:6的序列，优选地，其还包括：

25、seq id no:7的序列。

26、7.一种试剂盒，其包括项1-3中任一项所述的组合物或包括项4-6中任一项所述的寡核苷酸；

27、优选地，其还包含选自下述的至少一种其它组分：

28、三磷酸核苷、dna聚合酶和所述dna聚合酶功能所需的缓冲液；

29、优选地，所述试剂盒用于检测的样本包括：细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合；

30、优选地，其还包含：说明书。

31、8.根据项1-3中任一项所述的组合物或项4-6中任一项所述的寡核苷酸在制备用于体外检测膀胱癌的试剂盒中的用途。

32、9.根据项8所述的用途，其中，所述用于体外检测膀胱癌的试剂盒通过包括如下步骤的方法来检测膀胱癌：

33、1)分离待测生物样品中的包括目标基因的靶序列或其片段的dna样品；

34、2)确定所述目标基因的靶序列的甲基化状态；

35、3)通过所述目标基因的靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对膀胱癌的体外检测；

36、10.根据项8或9所述的用途，其中，所述方法包括如下步骤：

37、提取待测生物样品的基因组dna；

38、使用试剂处理提取的基因组dna，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；

39、将试剂处理过的dna样品与dna聚合酶和目标基因的靶序列的引物接触，进行dna聚合反应；

40、用探针检测扩增产物；以及

41、基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因的靶序列的至少一个cpg二核苷酸的甲基化状态；

42、优选地，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。

43、11.一种检测膀胱癌的方法，其包括如下步骤：

44、分离待测生物样品中的包括目标基因的靶序列或其片段的dna样品；

45、确定所述目标基因的靶序列的甲基化状态；以及

46、通过所述目标基因的靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对膀胱癌的体外检测；

47、所述目标基因为gata2基因，

48、优选地，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。

49、12.一种检测膀胱癌的方法，其包括如下步骤：

50、提取待测生物样品的基因组dna；

51、使用试剂处理提取的基因组dna，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；

52、将试剂处理过的dna样品与dna聚合酶和目标基因的靶序列的引物接触，进行dna聚合反应；

53、用探针检测扩增产物；以及

54、基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因的靶序列的至少一个cpg二核苷酸的甲基化状态；

55、所述目标基因为gata2基因，

56、优选地，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。

57、13.根据项11或12所述的方法，其中，所述gata2基因的靶序列如seq id nos:1-4中任一项所示的序列或包含seq id nos:1-4中任一项所示的序列。

58、14.根据项13所述的方法，其中，所述引物为：

59、所述seq id no:1或seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段，

60、优选地，所述引物如seq id no:5和seq id no:6所示的序列。

61、15.根据项13所述的方法，其中，所述探针为：

62、在中等严紧或严紧条件下杂交于所述seq id no:1或seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段，

63、优选地，所述探针为如seq id no:7所述的序列。

64、发明效果

65、本技术筛选出了能够灵敏和特异地检测膀胱癌相关标志物，并确定了相关标志物的甲基化区域。通过检测gata2基因的甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测所述基因的甲基化状态，从而可以用于对外周血游离dna的检测。通过对膀胱癌患者和正常对照个体的外周血样本的检测显示：本技术描述的组合物和检测方法能够灵敏和特异地检测膀胱癌，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。因此，本技术提供了一种可用于体外检测膀胱癌的组合物、试剂盒和检测方法，能够方便、快捷、有效地检测膀胱癌，具有重要的临床应用价值。

66、本技术利用表观基因组和生物信息学技术，通过分析膀胱癌的基因组甲基化数据，寻找到了多个与膀胱癌相关的甲基化基因，并确定了膀胱癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离dna的检测。

67、本技术所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。

68、通过利用实时pcr分析尿液样本dna的方法，能够方便地实现针对目标gata2基因靶序列甲基化状态的检测，并且能够根据实时pcr的ct值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，提供了一种无创、便捷的膀胱癌体外检测方法。