基于疏水标签技术的HBV核心蛋白降解剂及其制备方法与应用

本发明属于有机化合物合成与医药应用，具体涉及基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type b)，简称乙肝(hepatitis b)，是由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)所致的重大传染性疾病，长期发展可导致急慢性病毒性肝炎、重型肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)。尽管预防性hbv疫苗的覆盖率有所提高，全球仍有约2.57亿人患有乙肝相关疾病。目前，hbv临床治疗药物主要包括免疫调节剂干扰素类和病毒dna聚合酶抑制剂核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogs，nas)，然而这两种类别的药物都不能完全治愈乙肝。且核苷(酸)类似物停药后易反弹、长期用药易产生耐药性；干扰素类则有耐受性差、抗病毒效果中等、发生毒副反应风险高以及需要皮下注射等缺陷。因此，新型hbv抑制剂的研发迫在眉睫。hbv衣壳(核心)蛋白是组成病毒衣壳的结构蛋白，在病毒生命周期中发挥着至关重要的作用，并且介导病毒与宿主细胞的相互作用，对于维持hbv的感染性与稳定性具有重要意义。因此，hbv核心蛋白已成为抗hbv药物研究领域备受瞩目的新靶标。

2、近年来，靶向蛋白降解(targeted protein degradation，tpd)技术的出现，为药物发现带来了诸多机遇。靶向蛋白质降解技术通过劫持内源性蛋白质降解机制，从而诱导致病蛋白质的消耗或减少，和传统药物通过占据结合位点需要大量的药物分子相比，蛋白质诱导降解小分子仅需催化量就可以起到很好的抑制作用，展现出常规小分子抑制剂不具备的独特优势，为疾病治疗提供了一种新的选择。其中疏水标签(hydrophobic tagging，hyt)技术是继蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera，protac)技术的另一种高效模块化降解靶标蛋白的策略。hyt由靶标蛋白的配体和一个大的疏水基团构成，当hyt在细胞内结合靶标时，连接在靶标蛋白配体上的疏水基团模拟了蛋白未正确折叠的状态，进而被分子伴侣识别，随后经蛋白酶体降解。

3、本发明以两类代表性的hbv核心蛋白调控剂二氢嘧啶类化合物nvr-010-001-e2和磺酰苯甲酰胺类化合物nvr 3-778为靶蛋白配体，经结构微调后在其溶剂开口区通过不同长度和不同亲水性的linker和疏水标签相连，设计合成了两类共计30个hbv核心蛋白降解剂。此类化合物在现有技术中未见相关报道。

4、

技术实现思路

1、本发明提供了基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂及其制备方法与应用，本发明还提供了上述化合物抗hbv的活性筛选结果及其制药应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、1.基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂

4、基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂，具有如下式(i)或式(ii)所示的化合物结构或其药学上可接受的盐：

5、

6、其中，x为连接子，y为疏水基团。

7、优选的是，所述连接子包括结构通式如下所示的化合物：

8、

9、优选的是，所述疏水基团包括结构通式如下a～g所示的化合物：

10、

11、根据本发明进一步优选的，基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂是下列化合物之一：

12、

13、

14、本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式i及式ii化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见s.m.birge等，j.pharm.sci.,1977,66,1-19页。

15、2.基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂的制备方法

16、本发明还提供了所述的基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂的制备方法，合成路线如下：

17、目标产物hyt-h1的合成：以2-噻唑甲脒盐酸盐(i-1)、2-溴-4-氟苯甲醛和乙酰乙酸乙酯为起始原料，通过“biginelli”反应环合得到关键中间体i-2；在二氯甲烷溶液中，i-2与n-溴代丁二酰亚胺发生溴代反应得到中间体i-3；以i-3为原料，加入碳酸钾、碘化钾和1-boc哌嗪，在乙腈溶液中75℃回流1小时，得到中间体i-4；i-4在三氟乙酸的作用下脱掉boc基团得到中间体i-5；将金刚烷乙酸和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)在冰水浴中反应半小时，加入i-5和n,n-二异丙基乙胺(diea)室温搅拌过夜得到目标产物hyt-h1；

18、

19、试剂与条件：(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，乙酸钠，乙醇，90℃；(ii)n-溴代丁二酰亚胺，二氯甲烷，40℃；(iii)1-boc-哌嗪，碳酸钾，碘化钾，乙腈，75℃；(iv)三氟乙酸，二氯甲烷，0℃→室温；(v)金刚烷乙酸，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温。

20、目标产物hyt-s1的合成：以3-氯磺酰基-4-氟苯甲酸(ii-1)为起始原料，在甲苯溶液中以二氯亚砜为酰氯化试剂进行羧基的氯酰化反应得到中间体ii-2；ii-2在甲苯溶液中与3,4,5-三氟苯胺发生亲核酰基取代反应得到中间体ii-3；4-boc-氨基哌啶在二氯甲烷溶液中与ii-3反应，再加入三乙胺为缚酸剂反应得到中间体ii-4；ii-4在三氟乙酸的作用下脱掉boc基团得到中间体ii-5；将金刚烷乙酸和hatu在冰水浴中反应半小时，加入ii-5和diea室温搅拌过夜得到目标产物hyt-s1。

21、

22、试剂与条件：(i)二氯亚砜，甲苯，dmf，60℃；(ii)3,4,5-三氟苯胺，甲苯；(iii)4-boc-氨基哌啶，二氯甲烷，三乙胺，0℃→室温；(iv)三氟乙酸，二氯甲烷，0℃→室温；(v)金刚烷乙酸，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温。

23、目标产物hyt-h(2-9)的合成：将n-叔丁氧羰基-r1-羧酸和hatu在冰水浴中反应半小时，加入中间体i-5和diea室温搅拌过夜得到中间体i-6(a-h)；i-6(a-h)在三氟乙酸的作用下脱掉boc基团得到中间体i-7(a-h)；将金刚烷乙酸和hatu在冰水浴中反应半小时，加入i-7(a-h)和diea室温搅拌过夜得到目标产物hyt-h(2-9)。

24、

25、试剂与条件：(i)n-叔丁氧羰基-r1-羧酸，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温；(ii)三氟乙酸，二氯甲烷，0℃→室温；(iii)金刚烷乙酸，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温。

26、目标产物hyt-s(2-9)的合成：将n-叔丁氧羰基-r1-羧酸和hatu在冰水浴中反应半小时，加入中间体ii-5和diea室温搅拌过夜得到中间体ii-6(a-h)；ii-6(a-h)在三氟乙酸的作用下脱掉boc基团得到中间体ii-7(a-h)；将金刚烷乙酸和hatu在冰水浴中反应半小时，加入ii-7(a-h)和diea室温搅拌过夜得到目标产物hyt-s(2-9)。

27、

28、试剂与条件：(i)n-叔丁氧羰基-r1-羧酸，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温；(ii)三氟乙酸，二氯甲烷，0℃→室温；(iii)金刚烷乙酸，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温.

29、目标产物hyt-h(10-11,13-15)的合成：将含有不同疏水标签的羧酸化合物和hatu在冰水浴中反应半小时，加入中间体i-7f和diea室温搅拌过夜得到目标产物hyt-h(10-11,13-15)。

30、

31、试剂与条件：(i)r2-oh，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温。

32、目标产物hyt-s(10-11,13-15)的合成：将含有不同疏水标签的羧酸化合物和hatu在冰水浴中反应半小时，加入中间体ii-7f和diea室温搅拌过夜得到目标产物hyt-s(10-11,13-14)。将化合物ii-7f与三叔丁氧羰基精氨酸和n-甲基咪唑(nmi)溶解于乙腈中，室温搅拌10分钟，加入n,n,n',n'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐(tcfh)室温搅拌过夜得到目标产物hyt-s15。

33、

34、试剂与条件：(i)r2-oh，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温或者nmi，tcfh，乙腈，室温。

35、目标产物hyt-h12的合成：将己二酸单乙酯和hatu在冰水浴中反应半小时，加入中间体i-5和diea室温搅拌过夜得到中间体i-8；中间体i-8经氢氧化锂水解脱去酯基得到中间体i-9；将中间体i-9和hatu在冰水浴中反应半小时，加入降冰片烯-2-甲胺和diea室温搅拌过夜得到目标产物hyt-h12。

36、

37、试剂与条件：(i)己二酸单乙酯，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温；(ii)氢氧化锂，四氢呋喃：水，室温；(iii)降冰片烯-2-甲胺，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温.

38、目标产物hyt-s12的合成：将己二酸单乙酯和hatu在冰水浴中反应半小时，加入中间体ii-5和diea室温搅拌过夜得到中间体ii-8；中间体ii-8经氢氧化锂水解脱去酯基得到中间体ii-9；将中间体ii-9和hatu在冰水浴中反应半小时，加入降冰片烯-2-甲胺和diea室温搅拌过夜得到目标产物hyt-s12。

39、

40、试剂与条件：(i)己二酸单乙酯，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温；(ii)氢氧化锂，四氢呋喃：水，室温；(iii)降冰片烯-2-甲胺，hatu，diea，二氯甲烷，0℃→室温.

41、3.基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂的应用

42、本发明公开了基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂的抗hbv活性筛选结果及其作为抗hbv药物的应用。通过实验证明本发明基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂可用于制备抗hbv药物。

43、目标化合物的抗hbv活性和毒性实验

44、对按照上述方法合成的两类基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂进行了体外抗hbv活性评价和细胞毒性评价，通过qpcr法测定hbvdna抑制活性，通过cpe法测定细胞毒性。它们的抗hbv活性和毒性数据列于表1中，以二氢嘧啶类化合物gls4和磺酰苯甲酰胺类化合物nvr3-778为阳性对照。

45、本发明基于疏水标签技术设计的hbv核心蛋白降解剂呈现出显著的抗hbv活性。二氢嘧啶类hbv核心蛋白降解剂的活性在亚微摩尔至纳摩尔水平，其中化合物hyt-h2、hyt-h3、hyt-h4、hyt-h7、hyt-h9和hyt-h12处于和阳性对照gls4相当的水平。磺酰苯甲酰胺类多个hbv核心蛋白降解剂的抗hbv活性与阳性对照nvr3-778相当，如化合物hyt-s10、hyt-s11、hyt-s12和hyt-s14。具有进一步研究的价值。

46、目标化合物抗hbv作用机制验证

47、对目标化合物利用western blot测试了其对hbv核心蛋白含量的影响，结果如图1所示。以二氢嘧啶类化合物gls4和磺酰苯甲酰胺类化合物nvr 3-778为阳性对照。

48、western blot结果显示，与病毒对照组(tet-)相比，hyt-h2、hyt-h3、hyt-h4、hyt-h5、hyt-h7和hyt-h12在浓度为0.4μm时可显著降低hbv核心蛋白的含量；hyt-s7和hyt-s9能够剂量依赖性地降低hbv核心蛋白的含量。因此，本发明为研发抗hbv药物提供了新的方向。

49、本发明基于疏水标签技术设计合成的hbv核心蛋白降解剂是一类结构且机制新颖的化合物，可作为抗hbv药物应用。

50、本发明利用构建的hbv核心蛋白降解筛选模型，经合成优化，发现了所合成的小分子降解剂能够有效地降解hbv核心蛋白在体外的表达水平，为通过hbv核心蛋白来治疗乙肝提供了潜在的治疗手段。

51、一种抗hbv药物组合物，包括本发明基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

52、本发明公开了基于疏水标签技术的hbv核心蛋白降解剂、其制备方法、抗hbv活性筛选结果、降解hbv核心蛋白结果及其作为抗hbv药物的首次应用。