结肠癌特异性环状RNA标记物及其检测引物与应用

本发明属于生物，具体涉及结肠癌特异性环状rna标记物及其检测引物与应用。

背景技术：

1、结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年大约新增一百万的结肠癌患者有五十万左右的结肠癌患者死亡。随着分子生物学技术的不断进步，结肠癌检测分子标记物均有一定的进展，但临床上尚缺乏在核酸水平的快速有效和精准的分子标记物，因此应该拓宽该领域的研究，积极寻找一种新型标记物。筛选有效预测结肠癌的分子标记物，可作为普查筛选手段，或可提供结肠癌的早期诊断线索。

2、环状rna（circrna）与传统的线性rna（linear rna，含5'和3'末端）不同，circrna分子呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circrna分子富含microrna（mirna）结合位点，在细胞中起到mirna海绵（mirnasponge）的作用，进而消除mirna对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源rna（competing endogenous rnas，cerna）机制。通过与疾病关联的mirna相互作用，circrna在疾病中发挥着重要的调控作用。circrna在结肠癌的发生及发展中的作用及其机制已经成为研究新热点。功能性circrna能够直接或间接调控癌基因或抑癌基因的表达，提示其可作为肿瘤诊断的标记物有非常广阔的前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于结肠癌诊断、筛查或预后评估的结肠癌特异性环状rna标记物及其检测方法与应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了实现上述目的，本发明首先提供了分子标记物的下述任一种应用：

3、a1）在制备用于结肠癌诊断或辅助诊断的产品中的应用；

4、a2）在制备用于结肠癌筛查或辅助筛查的产品中的应用；

5、a3）在制备用于结肠癌预后评估的产品中的应用；

6、a4）作为靶点在制备用于抑制结肠癌细胞迁移或转移的药物中的应用；

7、a5）作为靶点在制备治疗或预防结肠癌的药物中的应用；

8、所述分子标记物为circrna，所述circrna的核苷酸序列可如seq id no.1所示。

9、所述分子标记物名称可为has-circ_0000419，其为环状rna（circrna）。所述has-circ_0000419在结肠癌患者中的表达水平显著低于在健康人中的表达水平。has-circ_0000419低表达患者的生存时间短，与较差的结肠癌预后显著相关。

10、所述has-circ_0000419可以作为分子标记物用于结肠癌的诊断、辅助诊断、筛查、辅助筛查或预后评估等分子诊断领域。

11、本发明还提供了检测所述分子标记物的物质的下述任一种应用：

12、b1）在制备用于结肠癌诊断或辅助诊断的产品中的应用；

13、b2）在制备用于结肠癌筛查或辅助筛查的产品中的应用；

14、b3）在制备用于结肠癌预后评估的产品中的应用。

15、上述应用中，所述物质可包括特异性扩增所述分子标记物的引物、特异性识别所述分子标记物的探针和/或特异性结合所述分子标记物的结合剂。

16、上述应用中，所述引物可为引物对，所述引物对可由上游引物和下游引物组成，所述上游引物可为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna，所述下游引物可为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna。

17、所述上游引物名称可为has-circ_0000419-forward，所述下游引物名称可为has-circ_0000419-reserve。所述has-circ_0000419-forward（seq id no.2）和has-circ_0000419-reserve（seq id no.3）为根据has-circ_0000419的序列结构特征（seq idno.1），在has-circ_0000419反向拼接区域设计的特异性引物，用于检测has-circ_0000419。

18、所述分子标记物或所述引物对也在本发明的保护范围内。

19、本发明还提供了所述引物对在制备检测所述分子标记物的产品中的应用。

20、本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒可包括本文中任一所述检测所述分子标记物的物质，所述试剂盒可用于检测所述分子标记物或用于结肠癌的诊断、辅助诊断、筛查、辅助筛查或预后评估。

21、进一步地，所述试剂盒的检测样本可为血液样本（如全血、血浆、血清）、组织样本等但不限于此。

22、进一步地，所述试剂盒还可包括pcr扩增所需要的taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg2+中的一种或多种。

23、进一步地，所述试剂盒还可包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂用于提取来自受试者的生物样品（待测样本）中的核酸。

24、进一步地，所述试剂盒还可包括内参基因检测试剂，所述内参基因可为gapdh基因和/或β-actin基因但不限于此。

25、所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

26、本发明还提供了检测所述分子标记物的方法，所述方法可包括利用所述引物对或所述试剂盒对待测样品进行检测。

27、进一步地，所述检测所述分子标记物的方法可包括如下步骤：

28、c1）提取待测样本rna；

29、c2）将所述rna反转录为cdna；

30、c3）以所述cdna为模板，以has-circ_0000419-forward（seq id no.2）和has-circ_0000419-reserve（seq id no.3）为引物进行pcr反应。

31、进一步地，所述pcr反应可为rt-pcr反应或数字微滴pcr反应。

32、本发明还提供了过表达本文中所述circrna（has-circ_0000419）的试剂或药物的下述任一种应用：

33、d1）在制备用于抑制结肠癌细胞迁移或转移的药物中的应用；

34、d2）在制备治疗或预防结肠癌的药物中的应用。

35、本文中，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、检测卡、高通量测序平台或生物传感器。

36、本文所述产品可包括本文中任一所述检测所述分子标记物的物质。

37、上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

38、本发明所提供的检测所述分子标记物（has-circ_0000419）的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在人群中进行结肠癌的筛查时检测has-circ_0000419的表达水平，或进行结肠癌的易感性检测。

39、另外，本技术的检测所述分子标记物（has-circ_0000419）的方法还可以有许多其他用途，例如细胞水平检测所示分子标记物（has-circ_0000419）的表达量。

40、本发明人经过广泛而深入的研究，通过tcga数据库结合二代测序筛选到与结肠癌进展相关的新型circrna（has-circ_0000419），进一步针对has-circ_0000419这一新型分子标记物的反向拼接序列特点设计特异性引物，建立了has-circ_0000419的rt-pcr检测方法以及数字微滴pcr检测方法。本发明设计的引物和建立的检测方法具有良好的扩增效率和特异性。对34例中国结肠癌患者癌灶组织中表达量的检测，结果显示，has-circ_0000419在34例中国结肠癌患者癌灶组织中低表达，提示具有抑制结肠癌进展作用，且has-circ_0000419低表达与患者不良预后相关，能够更加精准的对结肠癌患者的生存预后进行评估。通过对过表达has-circ_0000419的lovo细胞的细胞迁移实验和肿瘤转移模型实验，结果表明过表达has-circ_0000419的试剂或药物能够抑制结肠癌细胞迁移转移。

41、综上，has-circ_0000419作为全新的circrna分子标记物在结肠癌的诊断、辅助诊断、筛查、辅助筛查或预后评估等方面具有良好的、潜在的临床应用价值，并且可作为靶点用于抑制结肠癌细胞迁移转移，在结肠癌研究和药物开发中具有广泛的应用价值。