一株暹罗芽孢杆菌2204B、生物菌剂及制备方法和在抗多重耐药革兰氏阴性菌中的应用与流程

：本发明属于微生物及生物制品，具体涉及一株暹罗芽孢杆菌2204b、生物菌剂及制备方法和在抗多重耐药革兰氏阴性菌中的应用。

背景技术

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背景技术：

1、随着我国畜禽养殖规模化发展及抗生素用量的增加，导致细菌耐药性增强，兽医临床出现多重耐药菌株和超级耐药菌株，已成为全球关注的焦点。抗生素耐药性严重威胁着公共卫生健康，且影响经济增长和经济稳定。2022年我国猪牛羊禽肉产量9227万吨，比上年增长3.8％。我国畜禽养殖抗生素年使用量达9.7万吨，占全球抗生素年消耗量近50％。抗生素是应对各类细菌感染性疾病的重要药物，抗生素耐药性菌株的出现以及食物链中药物毒性的残留己成为当前急需解决的关键问题。面对日益严峻的细菌耐药性问题，除了合理规范抗生素的使用外，寻找抗生素的替代品及新的抗微生物药物是解决该问题的重要措施。

2、药用植物内生菌(endophyte)是指能存在于药用植物体内，能单独合成与药用植物相同或类似的活性产物，且侵染后不会引起药用植物病害发生的微生物。内生菌可产生多种次级代谢物和新型天然产物。药用植物内生菌与药用植物长期共存，药用植物体内的各种活性成分使得药用植物内生菌所处的微生态系统具有多样性，所产生的代谢产物具有多样性且具有更好的活性。这些代谢产物具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、杀虫等活性，是筛选生物活性成分或先导化合物的良好来源。药用植物内生菌最早由德国的darnel于1904年发现，随后，科研工作者发现几乎所有药用植物都具有一种或多种内生菌。我国具有丰富的药用植物，除极少数药用植物的内生菌被研究外，大部分药用植物的内生菌尚未被认识。

3、一种新的微生物与新的天然小分子总是联系在一起的，因此内生菌及其次生代谢产物是获得新的先导物和新型天然活性产物的重要资源。从药用植物内生菌及其次级代谢产物中获取新型天然活性产物已有大量报道。strobel等(1993)年从短叶红豆杉(taxusbrevifolia nutt)的韧皮部中分离出一株能产生紫杉醇的内生细菌；邱德有等(1994)从云南红豆杉(t.yunnanensis)的韧皮部中分离出一株具有产紫杉醇的能力菌株；中山大学王伟等(1999)从南方红豆杉(t.chinensis var.mairei)韧皮部分离得到6个能合成分泌紫杉烷类化合物的菌株；张玲琪等(1996)分别从抗癌药用植物长春花(catharanthusroseus)、桃儿七(sinopodophyllum hexandrum)等植株中分离到产抗癌药物长春新碱和鬼臼毒素类似物的内生细菌；张玲琪等在德国莺尾(irisgermanica)根状茎中分离得到产莺尾酮的内生细菌；陈双林等(2003和2004)分别从银杏(ginkgo biloba)和杜仲(eucommia ulmoides)中分离到能产黄酮类物质的内生菌。

4、药用植物内生菌及其代谢产物作为一种新型亟待开发的药用微生物资源，其丰富的微生物和次级代谢产物多样性为寻找新型抗耐药微生物活性物质提供了基础，显示出极具潜力的研究开发价值。因此，从药用植物中分离并筛选能产生与其寄主植物相同或相似的天然活性物质的研究成为了国内外学者广泛重视的研究领域。

5、因此，基于上述情况，研究开发金银花及其组织内生菌，并对其抗菌效果及抗菌活性物质进行研究，为抗耐药微生物的筛选及活性物质筛选奠定基础，为新型饲料添加剂、新型天然产物及新型抗耐药微生物药物的研究提供参考。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明要解决的技术问题是：基于上述药用植物内生菌及其代谢产物的研发情况，本发明研究开发金银花及其组织内生菌，并对其抗菌效果及抗菌活性物质进行研究，为抗耐药微生物的筛选及活性物质筛选奠定基础，为新型饲料添加剂、新型天然产物及新型抗耐药微生物药物的研究提供参考。

2、针对目前兽医临床病原菌耐药性强、无敏感药物可选的困局，本发明提供一株暹罗芽孢杆菌2204b、生物菌剂及其制备方法和在抗多重耐药革兰氏阴性菌中的应用。

3、为此，本发明提供的技术方案如下：

4、本发明提供一株暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b，所述暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：27157。

5、所述暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b的保藏信息如下：

6、分类命名：bacillus siamensis 2204b；

7、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；

8、保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

9、保藏日期：2023年4月19日；

10、保藏编号：cgmcc no：27157。

11、序列见seq id no.1。

12、根据上述的暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b，其序列如seq id no.1，具体为：

13、gtgcgtgcgggtctataatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaaggtgggacagatgatgggggaagtcgtaacaagagcgtcgtgg。

14、根据上述的暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b，所述暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b从金银花及其植物组织中筛选得到。

15、另外，提供一种暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b生物菌剂，包括所述暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b和/或所述暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b的代谢产物。

16、本发明一种暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b生物菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

17、a、将暹罗芽孢杆菌2204b接种到胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基上，在30～35℃下培养24～72h；

18、b、将步骤a培养后的菌种接入胰蛋白胨大豆液体培养基内，在30～35℃下培养24～36h，得到种子液；

19、c、将步骤b所得种子液按照1～3％的体积比接种量接种于发酵培养基中，在30～35℃、转速120～240rpm、ph 6.8～7.2条件下发酵培养24～48h，收集发酵液，得到微生物菌剂；或者用喷粉设备将收集的发酵液喷成粉，得到微生物菌剂粉剂。

20、根据上述的暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b生物菌剂的制备方法，所得微生物菌剂的活菌浓度为9～12×1011cfu/ml。

21、本发明暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b或暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)2204b生物菌剂在抗多重耐药革兰氏阴性菌上的应用。

22、根据上述的暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b或暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)2204b生物菌剂在抗多重耐药革兰氏阴性菌上的应用，所述应用是在防治多重耐药革兰氏阴性菌副猪嗜血杆菌、携带ndm-5超级耐药大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和/或巴氏杆菌上的应用。

23、本发明的积极有益效果：

24、1、本发明从金银花及其组织中分离筛选出的暹罗芽孢杆菌2204b及依据该暹罗芽孢杆菌制备的生物菌剂对多重耐药革兰氏阴性菌均有较强的抑菌杀菌效果。暹罗芽孢杆菌2204b对多重耐药革兰氏阴性菌有较强的拮抗作用，通过抑菌圈法验证了暹罗芽孢杆菌2204b的拮抗抑菌和杀菌效果：暹罗芽孢杆菌对携带ndm-5超级耐药大肠杆菌的抑菌圈大小为42mm；暹罗芽孢杆菌对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌的抑菌圈大小为25mm；暹罗芽孢杆菌对多重耐药副猪嗜血杆菌的抑菌圈大小为38mm；暹罗芽孢杆菌对多重耐药巴氏杆菌的抑菌圈大小为22mm。

25、2、暹罗芽孢杆菌2204b发酵液对多重耐药革兰氏阴性菌有较强的抑菌杀菌作用：2204b菌株发酵液对携带ndm-5大肠杆菌抑菌圈为30mm；2204b菌株发酵液对胸膜肺炎放线杆菌抑菌圈为25mm；2204b菌株发酵液对巴氏杆菌抑菌圈为29mm；2204b菌株发酵液对副猪嗜血杆菌抑菌圈为26mm。试验结果充分证明了暹罗芽孢杆菌2204b的抑菌杀菌活性。

26、3、本发明生物菌剂的制备方法简单，按照口服、伴料或饮水中的任一种方式使用对多重耐药革兰氏阴性菌：副猪嗜血杆菌、携带ndm-5超级耐药大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌效果和巴氏杆菌上均能达到良好的抗菌效果，使用方便，无抗生素残留，高效安全。