基于三代测序检测HPV病毒融合状态的方法和试剂盒与流程

本发明涉及三代测序领域，具体地涉及基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法和试剂盒。

背景技术：

1、基于纳米孔测序的目标区域捕获方法在科研和临床检测领域逐渐被广泛应用。利用探针捕获并富集目标区域用于深度测序技术由于需要很少地测序数据量，因此能够降低检测成本以及数据分析过程中的计算工作量与计算时间。与全基因组测序相比，仅需相对较低的成本即可获得超高深度的测序数据。

2、人乳头瘤病毒(hpv)属于乳头瘤病毒科。hpv通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性。hpv基因往往融合会至宿主基因。然而，由于目前对hpv所发挥的作用缺乏认识，不清楚hpv基因融合与其作用的关系。如果能发现hpv在宿主基因组中的融合位点，并对此类融合位点进一步分类，则有利于进一步增强对hpv融合与相关疾病之间关系的认知。

3、目前公开了一些检测基因融合的现有技术。例如，中国专利公布cn106650254a公开了一种基于转录组测序数据检测融合基因的方法，其包括以下步骤：s1：对样本进行二代转录组测序和三代转录组测序，分别得到二代转录组测序数据和三代转录组测序数据；s2：将三代转录组测序数据与参考基因组进行比对，鉴定可能发生了基因融合的flnc读序以及可能参与融合的基因对，提取可能发生了基因融合的flnc读序的序列，并判断融合位置；s3：将所述二代转录组测序数据比对到s2中得到的可能的融合基因flnc读序，根据比对结果中非一致性成对读序的对数和结合读序的个数，以及所述可能发生了基因融合的flnc读序的个数，鉴定确实发生了融合的基因对。该专利申请通过结合三代转录组测序与二代转录组测序来检测融合基因，使得结合二代和三代测序支持证据的融合基因检测结果更为可靠。

4、再例如，中国专利公布cn107437002a公开了一种快速检测融合基因的方法，包括以下步骤：a.建立融合基因数据库：将已知的融合基因断裂点以及断裂点前面的n个序列和断裂点后面的m个序列组成种子，种子的集合形成融合基因数据库；b.获取待检测基因；d.将种子与待检测基因的序列数据比对，确定待检测基因的序列数据是否包含种子信息；e.当包含待检测基因包含种子信息时，则认为待检测基因内含有融合基因；否则认为不包含融合基因。该专利申请弃用了常规的融合基因寻找方法，通过建立新的融合基因数据库，采用执果索因的方式，不需要与人类基因组进行比较，避免了既耗时又可能产生错误的比对基因组步骤，使得此种方法检测速度可提高几十倍，很少的内存需求下完成分析，并且防止了比较错误引起的误判。

5、然而，目前没有基于杂交捕获和三代测序来检测病毒与宿主基因之间融合的技术。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的至少部分问题，发明人进行了深入研究，提出一种基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明的第一方面，提供基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其包括以下步骤：

3、(1)提供来源于生物样品的核酸片段，其中所述核酸包括dna和rna；

4、(2)通过杂交捕获分别富集dna和由rna获得的cdna中的目标序列，并分别构建文库并进行扩增，得到dna测序文库和rna测序文库；

5、(3)利用三代测序技术分别得到dna测序结果和rna测序结果，其中所述dna测序结果包含hpv基因在宿主基因组的插入位点信息，所述rna测序结果包含hpv融合转录本信息；和

6、(4)基于所述dna测序结果和所述rna测序结果检测hpv病毒融合状态。

7、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，所述生物样品为宫颈组织或宫颈细胞。

8、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，所述核酸片段长度为1-10k。

9、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，如果所述dna测序结果显示存在hpv基因在宿主基因组的插入位点，且所述rna测序结果显示存在对应于该插入位点的hpv融合转录本，则hpv病毒融合状态为活跃状态。

10、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，所述杂交捕获的探针以hpv病毒全基因组序列作为设计区域。

11、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，所述探针为5’端己炔修饰的单链dna探针。

12、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，所述探针的长度为100-150nt。

13、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，所述杂交捕获为纳米磁珠杂交捕获。

14、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，所述探针的序列如seq id no：1-261所示。

15、在某些实施方案中，根据本发明第一方面所述的基于三代测序检测hpv病毒融合状态的方法，其中，步骤(2)中杂交捕获时间低于45min，还优选低于30min。

16、本发明的第二方面，提供一种基于三代测序检测hpv病毒融合状态的试剂盒，其包括：

17、i.纳米磁珠偶联物，其包括探针和与其通过连接臂连接的微球；

18、ii.杂交缓冲液，其包括：20x sspe、10x denhardt’s solution、10mm edta、0.2％sds、0.1％ tween 20、cot-1 dna 5μg、20u rnase抑制剂、杂交增强剂；

19、iii.清洗液，其包括：0.1x ssc、0.1％ sds、0.1％ tween 20；和

20、iv.扩增试剂和接头引物；

21、其中，所述探针设计为能够分别富集dna和由rna获得的cdna中的目标序列，且所述探针以hpv病毒全基因组序列作为设计区域。

22、本技术通过对磁珠捕获系统组合三代纳米孔测序技术，对宫颈癌细胞系样本的捕获与分析，可有效获取hpv病毒dna和rna，以及病毒融合dna片段和融合转录本的信号，实现插入位点和融合转录本的双重富集和融合检测，不但找到病毒插入相关基因，也同时发掘活跃转录的病毒融合转录本，为临床检测诊断和治疗评估提供多组学数据支撑。利用纳米孔长片段测序的技术优势，也可以更有效地比对到病毒在基因组上的插入位点，比二代短片段测序检出插入位点提高一到两个数量级，并进一步找到更完整的病毒插入位点的特征谱。

23、在某些实施方案中，本发明通过纳米磁珠捕获试剂对低丰度目标序列杂交捕获，同时采用优化后的杂交试剂方案和纳米级磁珠的特性，使得常规需要过夜或4小时以上的杂交捕获过程在半小时内就即可快速完成，显著缩短了检测流程和时间，并且杂交效果与常规过夜杂交一致。