基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测方法、检测装置及其应用

本发明涉及基因检测技术，具体地，涉及一种基于crispr系统的单碱基突变基因的检测方法、检测装置及其应用。

背景技术：

1、单碱基突变与许多人类疾病有关，可作为早期临床诊断、实时监测和治疗人类癌症的生物标志物，例如肿瘤蛋白p53(tp53)，表皮生长因子受体(egfr)和大鼠肉瘤(ras)基因突变。因此，单碱基突变的检测对于促进癌症诊断和开发治疗方法具有极其重要的意义。作为一种“经典”单碱基突变，表皮生长因子受体(egfr)l858r(l858r替代中的外显子21突变)在非小细胞肺癌(nsclc)中过表达，egfr l858r对针对肿瘤患者有效的药物的酪氨酸激酶抑制剂敏感。因此，有必要检测egfr l858r突变以治疗和预后nsclc。然而，在临床样本中，突变型dna(mt)的一小部分(<0.1％)与许多野生型dna(wt)共存，这使得单碱基突变的检测具有挑战性。对单碱基突变进行高灵敏度和特异性的检测非常必要。

2、当前，已经开发了多种检测低丰度单碱基突变的方法，例如dna测序技术(二代测序，sanger测序等)，聚合酶链反应(pcr，包括等位基因特异性pcr，微滴数字pcr等)。这些方法具有检测限低的优点，但也存在操作过程复杂、反应组分复杂、突变dna非特异性吸附等缺点。因此，迫切需要一种特异性高、灵敏度高、成本低、耗时短的单碱基突变检测方法。

3、基于crispr的诊断提供了一种检测多个单碱基突变的替代方法，crispr-cas系统已广泛应用于基因编辑。在cas家族中，cas12a、cas13a和cas14在特异性识别和不加选择地切割靶单链dna序列后表现出非特异性切割活性。然而，对于仅由crispr系统的测定，很难实现高灵敏度确定单碱基突变，如何引入合适的工具与crispr系统相结合，以克服灵敏度的障碍，已成为亟需解决的问题之一。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的crispr系统测定单碱基突变灵敏度较低的问题，提供一种基于crispr系统的单碱基突变基因的检测方法、检测装置及其应用，该检测方法快速简便、效率高，且特异性好、灵敏度高。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种基于crispr系统的单碱基突变基因的检测方法，该方法包括以下步骤：

3、s1、根据目标单碱基突变基因及其相应的野生型基因，分别设计突变型引导rna、野生型引导rna、突变型基因引物对以及野生型基因引物对；

4、s2、将待测样品进行dna提取获得待测基因，将所述待测基因或者所述野生型基因与相应的引物对、限制性内切酶进行rpa扩增得到待测rpa产物和野生型rpa产物；

5、s3、将所述待测rpa产物或者所述野生型rpa产物与相应的引导rna进行crispr反应得到待测crispr产物和野生型crispr产物，检测所述待测crispr产物和野生型crispr产物的荧光强度得到待测样品荧光值和野生型荧光值，将所述待测样品荧光值与所述野生型荧光值进行比较分析。

6、优选地，步骤s1中，所述野生型基因为表皮生长因子受体egfr-858wt基因，所述目标单碱基突变基因为表皮生长因子受体egfr-858wt基因中存在一个碱基突变。

7、优选地，所述表皮生长因子受体egfr-858wt基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述目标单碱基突变基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

8、优选地，所述突变型引导rna的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述野生型引导rna的核苷酸序列如seq id no：4所示。

9、优选地，所述突变型基因引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no：5所示、反向引物的核苷酸序列如seq id no：6所示，所述野生型基因引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no：7所示、反向引物的核苷酸序列如seq id no：8所示。

10、优选地，步骤s1中，所述突变型引导rna和所述野生型引导rna分别在5’端连接有pam序列。

11、优选地，所述pam序列的核苷酸序列如seq id no：9所示。

12、优选地，步骤s2中，所述rpa扩增的rpa体系含有：所述待测基因或者所述野生型基因、相应的引物对、所述限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水。

13、优选地，所述待测基因或者所述野生型基因、相应的引物对、限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水的体积比为1:2-3:0.8-1.2:9-11:5-6:0.8-1.2:4-6。

14、优选地，所述限制性内切酶为msci酶。

15、优选地，所述rpa扩增的条件至少包括：温度为25-45℃，时间为10-60min。

16、优选地，步骤s3中，所述crispr反应的crispr体系含有：所述待测rpa产物或者所述野生型rpa产物、相应的引导rna、cas12a、crispr缓冲液、rna酶抑制剂、ssdna-fq报告基因和水。

17、优选地，所述cas12a、相应的引导rna、crispr缓冲液、rna酶抑制剂、ssdna-fq报告基因、待测rpa产物或者野生型rpa产物以及水的体积比为1:0.25-2:1.5-2.5:0.8-1.2:0.8-1.2:4-6:8-10。

18、优选地，ssdna-fq报告基因的核苷酸序列如seq id no：10所示；所述crispr缓冲液含有：8-12mm tris-hcl，8-12mm mgcl2，8-12mm nacl和80-120μg/ml牛血清白蛋白。

19、优选地，步骤s3中，所述crispr反应的条件至少包括：温度为30-45℃，时间为15-25min。

20、优选地，所述荧光强度采用酶标仪检测，所述酶标仪的激发波长为480-500nm，发射波长为510-540nm。

21、优选地，所述比较分析包括：判断所述待测样品荧光值相对于所述野生型荧光值是否有变化，或者计算所述待测样品荧光值相对于所述野生型荧光值的变化比值。

22、本发明第二方面提供一种基于crispr系统的单碱基突变基因的检测装置，该检测装置包括微流控芯片、用于控制所述微流控芯片进行检测操作的微流控制器和荧光检测器，所述微流控芯片包括芯片主体和位于所述芯片主体上的微通道，所述微通道形成至少一个相互独立的检测单元，每个所述检测单元包括用于进行dna提取的前处理区以及用于进行rpa扩增和crispr反应的反应区，所述荧光检测器用于检测所述反应区内crispr反应产物的荧光强度。

23、优选地，所述芯片主体为圆形有机玻璃成型件，所述微通道为位于所述芯片主体的一侧表面的亚敏膜通道。

24、优选地，所述荧光检测器为酶标仪，所述微流控制器为离心式微流控程控仪。

25、本发明第三方面提供上述的检测方法在制备疾病诊断试剂盒中的应用。

26、优选地，所述疾病为癌症，更优选为肺癌。

27、通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

28、本发明提供的检测方法在针对目标单碱基突变基因或野生型基因进行rpa扩增时，利用限制性内切酶剪切非突变的野生型基因，再结合crispr技术进行荧光强度检测，不仅能够达到高灵敏检测目标单碱基突变基因的目的，而且对目标单碱基突变基因具有高度的选择性，使得检测方法具有高灵敏度、高特异性、重复性高等特点，且该方法步骤简单、操作快捷，效率高、成本低且易于推广，可应用于护理点实时监测；优选情况下，在限制性内切酶采用msci酶时，能够更加有效地使得目标单碱基突变基因大量扩增，从而进一步提升检测灵敏度。

29、本发明提供的检测装置能够将上述检测方法应用于微流控芯片中，通过微通道中的流体流动来控制整个系统，集成度高、小型化，具有样品体积小、精度高、分析时间短、制造工艺简单等优点，使得检测方法实用性更高，可有效用于临床样品的检测。