一种菌核曲霉2JHP001、无菌体发酵液及应用

本发明属于生物技术微生物领域，尤其涉及一种菌核曲霉2jhp001、无菌体发酵液及在制备拮抗二尖梅奇酵母药物中的应用。

背景技术：

1、中华绒螯蟹（ eriocheir sinensis）又名河蟹、毛蟹、大闸蟹，隶属于十足目decapoda、方蟹科grapsidae、绒螯蟹属eriocheir，因其营养丰富、味道鲜美深受广大消费者喜爱。强烈的市场需求刺激了中华绒螯蟹养殖产业的迅速发展，目前养殖区域已扩展到江西、湖北、安徽、辽宁、内蒙古等多个省份和自治区，养殖方式也由最初的资源放流型发展为高密度集约化精养型，然而其病害问题却日益突出。2020年10月，马红丽等首次报道了辽宁地区的河蟹“牛奶病”，从病蟹体内分离到病原菌，并鉴定为二尖梅奇酵母（ metschnikowia bicuspidata）。bao等在2021年也报道了辽宁地区的河蟹“牛奶病”，通过注射感染试验证实其对河蟹的治病性，病原菌经26s rrna基因序列分析鉴定为二尖梅奇酵母，并观察了病蟹心脏、鳃及肌肉的组织病理变化。申洪彬通过二尖梅奇酵母的药敏实验，筛选出包括克霉唑在内的几种对二尖梅奇酵母有抑制作用的抗生素。但是，抗生素不仅制备成本高，而且长期大量使用会使致病菌株产生耐药性，同时广谱抗生素会杀灭水产动物肠道内部分有益菌以及造成体内大量抗生素残留积累，使水产食品的安全性受到严重的影响。

2、微生物群落内普遍存在着生物拮抗这一自然现象，生物拮抗是指在同一生态位中不同微生物之间存在生长受抑制的现象，拮抗菌就是利用这一规律与病原菌相互抵制、相互排斥、相互制约的微生物种群，通过添加拮抗菌等微生态制剂对水产动物疾病进行防治具有无污染绿色环保等很多优势，尤其是无菌体发酵液更利于环保。目前已有应用于水产养殖中的具有病原拮抗作用的有益微生物，包括一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等有益细菌以及部分非细菌类微生物，但对二尖梅奇酵母并没有拮抗作用。

3、曲霉属（aspergillus）真菌是一类存在于自然界不同生境中的丝状真菌，分布广泛，是土壤和大气微生物区系的正常组成部分，并参与自然界物质的分解过程。曲霉属真菌的代谢产物化学结构复杂多样，主要有多糖类、生物碱类、聚酮类、二酮吡嗪类、蒽醌类等，这些代谢产物具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗病毒等功能，同时曲霉能产生多种有机酸和酶，在食品和医药工业中有广泛的用途。菌核曲霉（ aspergillus sclerotiorum）是属于散囊菌目发菌科曲霉属的一种真菌，可生长在土壤、药材、双肩尺蛾幼虫、象鼻虫、红头苍蝇等基物上。菌核曲霉可引起农作物菌核病，如油菜菌核病，又称菌核秆腐病，主要危害油菜的茎、叶、花、角果、种子，严重影响油菜的产量和品质。此外，菌核曲霉还会引起水稻菌核病、油麦菜菌核病以及其他农作物的病害甚至会引起人类疾病。2016年，江北等从腐烂的水果、发霉的食物、土壤等样品中筛选到一株菌核曲霉（ a. sclerotiorum as-75），该菌株对水稻白叶枯病的病原水稻白叶枯菌（xoo）具有较强的抗菌作用。通过对菌核曲霉（ a. sclerotiorum  as-75）抗菌谱测定，其发酵滤液对水稻条斑病菌、大豆斑疹病菌、烟草野火病菌、番茄细菌性叶斑病菌、野油菜黄单胞菌、烟草青枯病菌、杨树枯萎病菌、小麦赤霉病菌、小麦全蚀病菌、苹果轮纹病菌和稻瘟病菌均有较好的抑制作用，即基本集中在农作物疾病方面的抑制，迄今为止未见曲霉属中有关于拮抗二尖梅奇酵母菌株的相关报道。

技术实现思路

1、本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种菌核曲霉2jhp001、无菌体发酵液及在制备拮抗二尖梅奇酵母药物中的应用。

2、本发明的技术解决方案是：一种菌核曲霉（ aspergillus sclerotiorum）2jhp001菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.40707。

3、一种菌核曲霉2jhp001菌株的无菌体发酵液，依次按照如下步骤进行制备：

4、步骤1. 采用平板划线分离法纯化分离

5、无菌条件下，挑取菌核曲霉2jhp001斜面菌种孢子于10 ml带玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡打散孢子以形成孢子悬浮液，将悬浮液以10倍梯度稀释至10-7，取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.2ml，涂布于pda培养基，于26-28摄氏度培养4-8d；

6、步骤2. 采用霉菌标准培养法培养

7、无菌条件下，用接种针挑取纯化分离培养基中单菌落孢子，接种于cya培养基，25℃培养7d；

8、步骤3.无菌体发酵液制备

9、使用生理盐水将长好的霉菌从平板上冲下，将孢子震荡打散，制备浓度为105 cfu/ml的孢子悬浮液，再将孢子悬浮液按10%接种量接种于ypd培养基中， 25℃培养7d，取培养物4℃ 12000r/min离心10min后，用0.22μm滤膜过滤，即得到菌核曲霉2jhp001菌株的无菌体发酵液。

10、一种上述的菌核曲霉2jhp001菌株在制备拮抗二尖梅奇酵母药物中的应用。

11、一种上述的菌核曲霉2jhp001菌株的无菌体发酵液在制备拮抗二尖梅奇酵母药物中的应用。

12、本发明的菌核曲霉2jhp001菌株及无菌体发酵液均对二尖梅奇酵母具有较强的拮抗作用，可用于制备拮抗二尖梅奇酵母药物，以防治水产动物等因二尖梅奇酵母菌引起的各种疾病，避免应用抗生素存在的弊病，具有无污染绿色环保等优点。

技术特征：

1.一种菌核曲霉（aspergillus sclerotiorum）2jhp001菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no. 40707。

2. 一种菌核曲霉2jhp001菌株的无菌体发酵液，其特征在于依次按照如下步骤进行制备：

3.一种如权利要求1所述的菌核曲霉2jhp001菌株在制备拮抗二尖梅奇酵母药物中的应用。

4.一种如权利要求2所述的菌核曲霉2jhp001菌株的无菌体发酵液在制备拮抗二尖梅奇酵母药物中的应用。

技术总结
本发明公开一种菌核曲霉2JHP001、无菌体发酵液及应用，所述菌核曲霉2JHP001已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 40707。菌核曲霉2JHP001菌株及无菌体发酵液均对二尖梅奇酵母具有较强的拮抗作用，可用于制备拮抗二尖梅奇酵母药物，以防治水产动物等因二尖梅奇酵母菌引起的各种疾病，避免应用抗生素存在的弊病，具有无污染绿色环保等优点。

技术研发人员：叶仕根,蒲森婷,李沐霏,时鑫然,李毅豪,单云盟
受保护的技术使用者：大连海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16