一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体涉及一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用。

背景技术：

1、环介导等温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification,lamp)是notomi于2000年发明的一种恒温核酸扩增方法，其特点是针对目标序列的6个区域设计4-6条特异引物，利用一种具有链置换活性的dna聚合酶在60-65℃反应温度下，60分钟内即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、检测效率高等特点，已在食品安全、微生物检验、临床诊断等方面得到了广泛应用。

2、lamp是识别了目标序列上6-8个独立的基因片段，而pcr是利用两条引物特异地识别目的片段的两个区域，因此从理论上讲，lamp应该比pcr具有更高的特异性。但事实上，已经有多个研究证实，因为引物数目较多，lamp更容易遇到由非特异扩增而带来的假阳性问题。

3、将荧光标记的探针用于lamp是提高特异性的最佳选择之一。最先使用taqman探针，此时需要具有5’-3’外切活性的酶，而外切酶活性与链置换活性是矛盾的。目前商品化bst聚合酶均尽可能避免残留5’-3’外切活性，各别商品化bst聚合酶(如neb bst 3.0)明确表示不具有5’-3’外切活性。如继续使用taqman探针需要额外添加具有5’-3’外切活性的taq酶。其次，通过添加其他酶实现对探针的切割，如加入高保真酶或rnase h进行探针切割并收集荧光，此类方法探针设计比较复杂，需要做相应的特别设计。如使用高保真酶时需要探针3’端的错配，添加rnase h时探针需要序列中插入rna残基。此外，还可以通过探针的特别结构实现荧光信号的变化，如分子信标探针、“蝎子”探针及双探针等，此类探针因为需要形成特别的二级结构(例如发夹、环、互补双链等)，需要添加额外的序列，对探针设计的要求较高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中存在的环介导等温扩增技术中荧光探针设计复杂，且需增加额外的序列或试剂才能进行检测的问题，提供一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于环介导等温扩增的引物探针组合，所述引物为针对目标核酸序列设计的特异性等温扩增引物，所述引物包括一对外引物f3、b3，一对内引物fip、bip，一对环引物lf、lb；所述探针为非酶切线性荧光探针，所述探针片段长度为16-30bp，探针序列位于目标核酸序列上外引物f3及b3结合位置之间的区域；所述探针5’末端的碱基上标记淬灭基团，3'末端的碱基或探针序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。

3、优选地，所述探针序列位于目标核酸序列上环引物lf及lb结合位置之间的区域。

4、优选地，所述探针3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。

5、本发明还提供了上述引物探针组合在新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒制备中的应用。

6、基于上述应用，本发明提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒，包括根据新型冠状病毒n基因设计的新型冠状病毒环介导等温扩增检测专用引物和探针：

7、外引物covn-f3：5’-agatcacattggcacccg-3’；

8、外引物covn-b3：5’-ccattgccagccattctagc-3’；

9、内引物covn-fip：5’-tgctcccttctgcgtagaagcttttcaatgctgcaatcgtgctac-3’；

10、内引物covn-bip：5’-ggcggcagtcaagcctcttcttttcctactgctgcctggagtt-3’；

11、环引物covn-lf：5’-tggcaatgttgttccttgaggaagt-3’；

12、环引物covn-lb：5’-cctcatcacgtagtcgcaacagttc-3’；

13、探针covn-lbp：5’-bhq1-cctcatcacgtagtcgcaacagtt(fam)c-3’，所述探针covn-lbp在序列5’端标记淬灭基团，3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。

14、优选地，所述试剂盒还包括根据内参基因人类β-actin设计的引物和探针：

15、外引物ab-f3：5’-tggtgggcatgggtca-3’；

16、外引物ab-b3：5’-tggccttggggttcagg-3’；

17、内引物ab-fip：5’-ggtacttcagggtgaggatgccttttgaaggattcctatgtgggcg-3’；

18、内引物ab-bip：5’-ccaactgggacgacatggagaattttagcacggggtgctcct-3’；

19、环引物ab-lf：5’-tcttgctctgggcctcgt-3’；

20、环引物ab-lb：5’-caccacaccttctacaatgagc-3’；

21、探针ab-lfp：5’-bhq3-tcttgctctgggcct(cy5)cgt-3’，所述探针ab-lfp在序列5’端标记淬灭基团，3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。

22、优选地，所述试剂盒中还包括bst聚合酶大片段、amv反转录酶及lamp反应液。

23、优选地，所述lamp反应液浓度为终浓度的2倍，所述lamp反应液包括：tris-hcl40mm、(nh4)2so4 20mm、kcl 50mm、0.2％ tween-20、mgso4 10～22mm、dntp 2.0～3.6mm。

24、优选地，所述lamp反应液中mgso4的终浓度为7mm。

25、优选地，所述lamp反应液中dntp的终浓度为1.4mm。

26、如图1所示，本发明利用非酶切线性探针结合lamp扩增方法相结合产生的荧光信号变化实现检测目标核酸序列，其方法原理的主要过程如下：

27、1)针对目标核酸序列设计特异性lamp扩增引物和荧光探针：在荧光探针5’末端的碱基上标记淬灭基团；在探针3'末端的碱基或序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团，更优的选择是距3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。

28、2)将引物探针同时添加至反应体系。反应初始，体系中绝大部分探针处于游离状态。因为淬灭基团的荧光淬灭效果，游离状态的探针几乎不发出荧光信号，此时仪器检测到的信号属荧光基线。

29、3)随着反应进行，产生大量产物模板。探针与模板结合后，双链dna结构可显著抵消淬灭基团对荧光的淬灭作用，此时的荧光基团在接受激发波长的紫外光的情况下可释放一定的荧光信号，该信号强度明显高于荧光基线。此时是3'末端标记荧光基团的探针发挥作用的主要原理。

30、4)对于非3’末端标记荧光基团的探针，更优的选择是距3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团，因为3’末端游离，可在bst聚合酶的作用下引导双链的合成。随着产物长度的增加，双链dna结构对淬灭基团的抵消作用更加明显，荧光基团发出荧光信号的强度更高。

31、本发明所具有的有益效果：

32、一)本发明在环介导等温扩增的基础上，通过引入一条特殊的线性荧光探针就可实现目标序列的特异性检测，该线性荧光探针为基于特异性等温扩增引物设计的非酶切线性序列，其设计简单灵活度高，该探针不需要在反应过程中被酶切，也不需要增加额外的序列以形成复杂的二级结构，使用时也不需要添加额外的试剂。通过探针在游离状态与结合状态间荧光强度的差异，实现目标核酸序列的检测；

33、二)本发明中建立了新型冠状病毒n基因lamp检测体系，该体系无需增加额外序列或试剂即可实现新型冠状病毒n基因的检测，特异性好，灵敏度高，操作简单，成本低廉。