检测大肠杆菌O157抗原的杂交瘤细胞DA3及单抗和应用的制作方法

本发明涉及检测领域，具体涉及检测大肠杆菌o157抗原的杂交瘤细胞，还涉及由该杂交瘤细胞分泌的单抗和在制备检测试剂中的应用。

背景技术：

1、大肠杆菌o157:h7(escherichia coli o157:h7)是一类能引起严重食物中毒的致泻性大肠杆菌,是出血性大肠杆菌ehec的主要血清型，感染剂量极低，潜伏期为3-10天，病程2-9天。通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，还可发生溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome,hus)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura，ttp)等严重的并发症,且后者病情发展快,死亡率高，在世界范围内得到普遍关注。ehec o157:h7引起的感染有明显的季节性，多发生于夏秋两季，7-8月为发病高峰。儿童和老年人的发病率明显高于其他年龄组，且并发hus和ttp的机率较高。农场动物，尤其是反刍动物，是ehec o157:h7在世界范围内的主要宿主。ehec的感染可直接传播(动物→人，人→人)，也可以通过间接传播(食物、水源→人)。由食源性ehec引起的感染，牛肉、生奶、鸡肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可收到污染，其中牛肉是最主要的传播载体。

2、ehec o157:h7已严重危害食品安全及人类健康，且目前还没有一种特效药和有效地治疗手段，因此对o157:h7的预防工作，重点是病原菌的检测就显得尤为重要。我国进出口食品对e.coli o157:h7目前采用的方法是以行业标准snt0973-2010作为依据。通过对样品增菌处理后，进行平板划线，然后挑取可疑菌落进行形态、染色及血清学试验、生化鉴定等进行判定。检测过程耗时长达4-7d，难以适应快速检验的要求。因此，需要有一种操作简便、结果准确可靠、可快速检测大肠杆菌o157:h7血清型的试剂。

3、优异的大肠杆菌o157:h7单克隆抗体，能够用于elisa、金标试纸条等不同用途的免疫学试验。使用合适的抗体配对，可开发出特异性检测大肠杆菌o157:h7感染的金标快速检测试纸条。使用金标检测试纸条检大肠杆菌o157:h7感染，不需要昂贵的设备和训练有素的专业人员，非常适合快速诊断。

4、双抗体夹心法是应用最广泛的一种免疫结合胶体金层析法。利用抗原抗体反应相结合的原理，用免疫金标记技术，以微孔膜为固相载体，实现对样品的定性、半定量等检测。双抗体夹心法是将首先将已知的特异性单抗或多抗包被于膜上作为检测带(t线)，可与金标物结合的二抗包被于膜上作为质控带(c线)。与包被抗体相配对的另一单抗与胶体金结合，吸附于金标垫作为检测信号。干燥的金标垫一端与膜相接，一端与样品垫相连。膜的另一侧粘贴吸水垫。检测时，加入样品垫上液体样品通过毛细管作用向吸水垫的方向移动，经过金标垫时，如标本中有待测抗原，则发生抗原抗体反应，形成金颗粒－抗体－抗原复合物；样本继续移动到达检测带位置，则与针对不同检测位点的包被抗体再次发生抗原抗体反应，形成金颗粒－抗体－抗原－包被抗体复合物，形成肉眼可见的t线，如样本中无待检抗原或待检抗原的浓度低于检测范围，则不能形成肉眼可见的红色条带。游离的金标结合物或金颗粒－抗体－抗原复合物越过检测带到达质控带，与二抗发生反应，聚集并产生肉眼可见的红色条带(c线)。无论样本中是否含有待检物质，质控带都会出现c线。

5、免疫结合胶体金层析法可对样品进行单份检测，具有操作便捷、不需要特殊设备和场地的优点。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在一定缺陷，如对样本的敏感度低，质量控制能力不够，批间、批内和不同试剂间变异系数过大等。因此，提高单克隆抗体对的敏感度和特异性，是弥补免疫结合胶体金层析法缺陷的重要手段。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种检测大肠杆菌o157抗原单克隆抗体杂交瘤细胞da3；本发明的目的之二在于提供所述杂交瘤细胞da3分泌的单克隆抗体da3；本发明的目的之三在于提供所述单克隆抗体da3在制备检测大肠杆菌o157抗原的检测试剂中的应用；本发明的目的之四在于提供含有所述单克隆抗体da3的检测试剂。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、检测大肠杆菌o157抗原单克隆抗体杂交瘤细胞da3，所述杂交瘤细胞da3保藏编号为gdmcc no：63528，保藏日期为2023年06月06日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。

4、2、所述杂交瘤细胞da3分泌的单克隆抗体da3。

5、3、所述单克隆抗体da3在制备检测大肠杆菌o157抗原的检测试剂中的应用。

6、本发明优选的，所述检测试剂的检测原理为胶体金法、免疫荧光层析法、酶联免疫法或化学发光法。

7、4、含有所述单克隆抗体da3的检测试剂。

8、本发明优选的，所述检测试剂的检测原理为胶体金法。

9、本发明优选的，所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测t线和质控c线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测t线包被抗体da3，所述胶体金垫上结合抗体cf6，所述抗体cf6由杂交瘤细胞cf6分泌。

10、本发明优选的，所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测t线和质控c线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测t线包被抗体da3，所述胶体金垫上标记抗体cf6，所述抗体cf6由大肠杆菌o157抗原单克隆抗体杂交瘤细胞cf6分泌，其保藏编号为gdmcc no.63527。

11、优选的，所述质控c线上包被l mg/ml羊抗鼠igg；所述t线上的单抗包被浓度为1mg/ml；所述胶体金标记的抗体按1ml胶体金结合20μg的抗体。

12、优选的，所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。

13、优选的，所述质控c线包被羊抗鼠igg本发明优选的，所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。

14、本发明优选的，所述质控c线包被羊抗鼠igg。

15、本发明的有益效果在于：本发明公开了大肠杆菌o157抗原单克隆抗体杂交瘤细胞da3，还公开了由该杂交瘤细胞da3分泌的单克隆抗体，杂交瘤细胞保藏编号为gdmcc no：63528，分泌的抗体用于检测大肠杆菌o157抗原具有特异性好和灵敏度高的优点，因此可以制备检测大肠杆菌o157抗原的试剂，也可以与配对抗体开发检测大肠杆菌o157抗原的试剂条，为大肠杆菌o157抗原的检测提供了新的工具。

16、生物材料保藏

17、本发明的大肠杆菌o157抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株da3保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为gdmcc no：63528，保藏日期为2023年06月06日，分类命名为babl/c小鼠杂交瘤细胞。

18、大肠杆菌o157抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株cf6进行保藏，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为gdmcc no.63527，保藏日期为2023年06月06日，分类命名为babl/c小鼠杂交瘤细胞。