一种耐高温的黄素单核苷酸结合荧光蛋白及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种耐高温的黄素单核苷酸结合荧光蛋白及其应用。

背景技术：

1、荧光蛋白是一种有价值的非侵入性分子成像工具，广泛用于活体成像、分子互作观察、生物元件活性考察、肿瘤活动等等。然而，现在应用最广泛的荧光蛋白(如gfp)通常仅限于有氧系统，因为它们的发色团的形成严格需要氧气。为了扩展荧光蛋白在无氧或低氧系统的应用，黄素单核苷酸结合荧光蛋白(flavin mononucleotide–based fluorescentprotein,fbfp)应运而生。fbfp主要由光、氧和电压(light,oxygen,and voltage,lov)结构域构成，与配体分子黄素单核苷酸结合后在蓝光激发下可以发出荧光。相比gfp及其衍生物，fbfp具有分子量小、不依赖氧气、荧光成熟快和抗逆性强等优点。这些优良特性表明fbfp有望成为比gfp及其衍生物更出色的荧光蛋白，可应用至微生物发酵、生物修复、厌氧污水处理、肿瘤转移、慢性炎症发展、脑缺氧缺血、微生物发病机制和生物膜形成等领域。

2、高荧光强度和强抗逆性被认为是荧光蛋白至关重要的特性。当荧光蛋白处于不利的非天然条件下，容易导致三维结构变化进而降低荧光发出或失去荧光。改进荧光蛋白的性能可以通过定向进化的方法，包括非理性设计、半理性设计和理性设计。例如，通过易错pcr获得一个来源于pseudomonas putida的sb2高荧光突变体。通过计算机辅助理性设计使来源于bacillus subtilis的ytva的tm值提高了31℃。然而，对于生活在极端环境如高温、高静水压、高渗、严格厌氧等环境的原核微生物，还有很多无法利用现有的荧光蛋白进行生物学研究。这说明现有荧光蛋白需要进一步改进以拓宽其应用范围。

3、因此，本领域的技术人员致力于开发一种能用于严格厌氧超嗜热菌种中的荧光标记热稳定改善的黄素单核苷酸结合荧光蛋白及其定向进化筛选方法和应用。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种能用于严格厌氧超嗜热菌种中的荧光标记热稳定改善的黄素单核苷酸结合荧光蛋白，以及其应用方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种黄素单核苷酸结合荧光蛋白ynp3y116f的突变体a57s，氨基酸序列如seq id no.3所示。

3、本发明还提供了一种差示扫描荧光法在黄素单核苷酸结合荧光蛋白ynp3y116f突变文库的定向进化筛选中的应用。

4、进一步地，该应用包括以下步骤：

5、步骤1、构建黄素单核苷酸结合荧光蛋白ynp3y116f的突变文库，得到在目的氨基酸位点的饱和突变文库；

6、步骤2、将步骤1得到的饱和突变文库在大肠杆菌宿主中的诱导表达，得到菌液；

7、步骤3、将步骤2得到的菌液制备成初筛样品，通过差示荧光扫描法对初筛样品筛选，得到tm值相较野生型提高的单点突变体；

8、步骤4、将步骤3得到的单点突变体和ynp3y116f分离纯化，得到纯化后的单点突变体；

9、步骤5、将步骤4得到的纯化后的单点突变体在热球菌中诱导表达。

10、进一步地，步骤1还包括综合abacus算法和b-factor选定饱和突变位点。

11、进一步地，步骤1还包括以下步骤为：

12、步骤1.1、根据黄素单核苷酸荧光蛋白ynp3y116f的氨基酸序列，以及热球菌的密码子偏好性，合成了编码ynp3y116f的基因片段；

13、步骤1.2、使用discovery studio确定ynp3y116f配体分子fmn周围范围内的氨基酸，并计算这些氨基酸的b-factor值，由统计能量函数abacus计算出每个氨基酸残基的自由能，综合考虑选取其中自由能低且b-factor值相对较高的十个残基进行饱和突变，获得热稳定性提高的ynp3y116f突变体。

14、进一步地，步骤1还包括：

15、步骤1.3、将ynp3y116f编码基因序列克隆重组至载体pet-28a，得到第一重组质粒pet-28a-ynp3y116f，将第一重组质粒pet-28a-ynp3y116f通过热激法转化至表达宿主大肠杆菌bl21(de3)中，建立ynp3y116f在大肠杆菌中的异源表达；

16、步骤1.4、通过运用简并引物对步骤1.3得到的在dh5α中异源表达后的重组质粒进行全质粒pcr扩增,通过核酸凝胶电泳验证分离并纯化目的片段；将纯化回收的产物用dpni酶进行消化处理，去除模板质粒得到目的片段；

17、步骤1.5、将步骤1.4得到的目的片段克隆重组至载体pet-28a，得到第二重组质粒pet-28a-ynp3y116f，将第二重组质粒pet-28a-ynp3y116f通过热激法转化至大肠杆菌bl21(de3)中，在含有卡那霉素抗性的lb平板中37℃过夜培养，随后挑取部分单克隆进行测序检验，构建在目的氨基酸位点的饱和突变文库。

18、进一步地，步骤1.5中lb平板中卡那霉素含量为50μg/ml。

19、进一步地，步骤3中制备成初筛样品的方法为：使用紫外分光光度计测量完成诱导的菌液的od600值，将各菌液的od600值统一至2.0，第一次离心收集菌体，反复冻融，加入溶菌酶重悬，于37℃反应,第二次离心收集反应液上清，作为初筛样品。

20、进一步地，步骤3中通过差示荧光扫描法对初筛样品筛选的步骤如下：

21、步骤3.1以野生型作为对照组，饱和突变文库作为实验组，pbs缓冲液作为无模板空白对照(no template control,ntc)，将初筛样品加入96孔qpcr板，每孔50μl,每个样品在同一块qpcr板上进行3个技术重复,使用高透光性封板膜将qpcr板密封；

22、步骤3.2反应程序设置：detection format默认为sybr green/hrm dye，37℃平衡4min，随后以1℃/min的速率从38℃升温至90℃测定样品的tm值；tm值为当荧光强度降至初始荧光一半时的温度。

23、进一步地，步骤4中纯化的方法为镍柱亲和层析。

24、本发明还提供了一种黄素单核苷酸结合荧光蛋白ynp3y116f的突变体a57s在严格厌氧超嗜热古菌中作为荧光标记的应用。

25、在本发明的较佳实施方式1中，详细说明构建黄素单核苷酸结合荧光蛋白ynp3y116f的突变文库的过程；

26、在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明ynp3y116f及其突变文库在大肠杆菌宿主中的诱导表达过程；

27、在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明突变体文库的筛选过程；

28、在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明ynp3y116f及a57s的分离纯化过程；

29、在本发明的另一较佳实施方式5中，详细说明a57s在热球菌中的诱导表达过程；

30、在本发明的另一较佳实施方式6中，详细说明a57s在热球菌中的荧光显微镜镜检过程。

31、本发明有益的技术效果如下：

32、本发明首次在严格厌氧超嗜热古菌中应用荧光标记，通过定向进化获得热稳定改善的突变体，构建表达载体，使用热球菌转化方法获得重组菌株。该突变体能够顺利应用至生长温度在85℃的热球菌的荧光成像中，其对于研究在超高温和高静水压的极端环境下的生物元件性能，分子互作，生物传感器等等具有广阔应用前景。

33、本发明引入差示荧光扫描技术作为突变文库的筛选方法，可实现同时筛选荧光强度和热稳定性两个特性。差示扫描荧光法是在荧光定量pcr仪上缓慢加热样品，在加热的过程中由于荧光蛋白三维结构发生变化，体现在荧光信号强度的检测上，以此评价蛋白质的热稳定性。该筛选方法同时适用于所有具有荧光信号并需要改善热稳定性的蛋白质。

34、本发明综合abacus算法和b-factor选定饱和突变位点，克服了定向进化的突变库不够精细会使进化过程筛选压力非常大，费时费力的问题。使用discovery studio软件确定配体分子fmn周围范围内的氨基酸，并计算这些氨基酸的b-factor值，同时由统计能量函数abacus计算这些氨基酸的自由能。缩小突变库容量，大大提升了筛选效率，快速获得正向突变体。

35、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。