轮状病毒保护剂、轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法与流程

本发明属于疫苗制剂制备，具体涉及一种轮状病毒保护剂、轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法。

背景技术：

1、轮状病毒流行株多样性的特点，决定了多价疫苗才是最有效预防轮状病毒腹泻的方法，然而目前市场上的主要轮状病毒疫苗，兰州生物制品研究所的罗特威以及gsk公司的rotarix均为单价血清型轮状病毒疫苗，血清型涵盖范围小，merck公司的rotateq虽然为五价轮状病毒疫苗，但血清型中不含有g8、g9血清型，对主要血清型流行株囊括范围小，其在非洲马拉维(g8血清型为优势流行株)的临床试验结果显示，对重症轮状病毒腹泻的保护率仅为40%。因此，需要一个更为全面的多价轮状疫苗。含有g1、g2、g3、g4、g8、g9的六价轮状病毒在保护范围上具有明显优势。但六价轮状病毒疫苗需要六种血清型病毒原液进行混合配比，对单价原液滴度要求较高。

2、轮状病毒疫苗的生产过程主要包括：在哺乳动物细胞中增殖轮状病毒、细胞破碎释放病毒、去除细胞碎片得到单次病毒收获液、加入辅料配比等步骤。已上市的轮状病毒疫苗主要采用冻融工艺进行细胞破碎，将细胞放入低温下迅速冷冻，在高温下融化而达到破壁作用。但在冻融操作中，细胞工厂需要先转入低温冷库冷冻，再转入37℃定温室进行融化，操作繁琐，耗时长，且细胞工厂来回搬运易破损，增加污染风险；同时需要更大或更多的定温室和低温冷库，能耗大，占用车间设计空间，生产成本高。另外，冻融可能存在细胞破碎效率低，病毒释放不彻底的情况，病毒生产效率低，且冻融后细胞碎片大小不一，增加后续纯化难度。多价疫苗成品需将所有的血清型原液生产完成后再配制，原液储存周期较长，一般采取冷冻保存，需建立冷冻保存冷库。

3、高压均质法是利用高压均质机的高压剪切作用破碎细胞，相比冻融法和化学试剂法，具有快速，占地小，无需后续去除残留的优点，一般用于食品乳化、细菌及酵母类菌体破碎和灭活病毒疫苗的细胞破碎。高压均质过程一般需要料液循环均质才能取得较好的均质效果，但均质过程会产生热量，循环均质对料液的升温明显，用于活病毒疫苗的制备对病毒活性损伤较大；同时，高压剪切作用对病毒活性也有较大损伤。因此，将高压均质法用于活病毒疫苗的制备需解决病毒活性受损而造成的病毒回收率较低的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高滴度、低杂质含量且稳定性高的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，同时缩短生产工艺流程、提高生产效率、降低生产成本，制备的轮状病毒减毒活疫苗原液可用于多价轮状病毒疫苗的配制。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一方面，本发明提供一种轮状病毒保护剂，由谷氨酸钠、氯化锌、氯化钙、蔗糖溶解于注射用水制成，各组分浓度为：谷氨酸钠0.3~0.8m、氯化锌5~15mm、氯化钙10~25mm、蔗糖2~2.5m。

4、作为优选，所述轮状病毒保护剂各组分浓度为：谷氨酸钠0.5m、氯化锌10mm、氯化钙20mm、蔗糖2.3m。

5、另一方面，本发明提供一种轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，包括如下步骤：

6、s1. 病毒培养：vero细胞复苏后置于37℃培养，连续传代扩增，当细胞生长为致密单层后，接种轮状病毒，置于培养液中培养；

7、s2. 病毒收获：当50%~75%的细胞出现病变效应时，先收集病毒培养上清至储液罐中，再向病毒培养容器中加入细胞洗脱剂，使未完全病变的细胞脱落，收集脱落的细胞加入储液罐，与病毒培养上清混合，得收获液；

8、s3. 细胞破碎：向收获液中加入轮状病毒保护剂，采用高压均质方式破碎细胞，均质压力200~400bar；

9、s4. 过滤超滤：将高压均质后的料液，依次通过0.5~1.0μm孔径和0.2μm孔径滤膜澄清过滤，再经300k孔径超滤膜超滤、浓缩，最后经0.2μm孔径滤膜除菌过滤，即得轮状病毒减毒活疫苗原液。

10、作为优选，步骤s1中，所述轮状病毒的接种量按照病毒感染复数0.005~0.1进行计算。

11、作为优选，步骤s1中，所述培养液中含有胰蛋白酶，ph值为7.8-8.0，温度为35~37℃，所述胰蛋白酶的浓度为5~20μg/ml。

12、作为优选，步骤s2中，所述细胞洗脱剂为枸橼酸钠和吐温80的水溶液，所述枸橼酸钠的浓度为0.05~0.2m，所述吐温80的浓度为5~10g/l。

13、作为优选，步骤s3中，所述轮状病毒保护剂各组分浓度为：谷氨酸钠0.3~0.8m、氯化锌5~15mm、氯化钙10~25mm、蔗糖2~2.5m。

14、作为优选，步骤s3中，所述轮状病毒保护剂与收获液的体积比为0.7~1.2:10。

15、作为优选，步骤s3中，所述高压均质进液速度10~20l/min，进液温度2~8℃，循环均质2~3次。

16、作为优选，步骤s4中，所述料液温度为2~25℃，，所述浓缩为进行5~10倍浓缩。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、（1）本发明提供的轮状病毒保护剂能够提高轮状病毒的稳定性，降低高压均质过程中高压剪切作用和均质升温对病毒活性的损伤，原液中病毒滴度高，可在2~8℃长期保存，无需冷冻保存；保护剂成分可存在于疫苗成品中，无需增加去除步骤。

19、（2）本发明提供的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法生产工艺流程周期短、生产效率高、生产成本低。采用细胞洗脱剂促进病变细胞脱落，缩短了病毒培养时间，提高了病毒收获率；细胞洗脱剂中的吐温80成分，有利于均质过程中的乳化作用，提高均质效率。采用高压均质法破碎细胞，能够快速高效地进行病毒收获，在轮状病毒保护剂保护下，细胞充分破碎、粒径均一，宿主细胞dna被剪切至700bp以下，能够减少病毒与dna吸附结团，避免病毒在后续过滤过程中被截留，提高病毒回收率，且有利于过滤超滤过程中去除宿主蛋白和dna，降低产品中的杂质含量。

技术特征：

1.一种轮状病毒保护剂，其特征在于，由谷氨酸钠、氯化锌、氯化钙、蔗糖溶解于注射用水制成，各组分浓度为：谷氨酸钠0.3~0.8m、氯化锌5~15mm、氯化钙10~25mm、蔗糖2~2.5m。

2.根据权利要求1所述的轮状病毒保护剂，其特征在于，各组分浓度为：谷氨酸钠0.5m、氯化锌10mm、氯化钙20mm、蔗糖2.3m。

3.一种轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述轮状病毒的接种量按照病毒感染复数0.005~0.1进行计算。

5.根据权利要求3所述的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述培养液中含有胰蛋白酶，ph值为7.8-8.0，温度为35~37℃，所述胰蛋白酶的浓度为4~5μg/ml。

6.根据权利要求3所述的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述细胞洗脱剂为枸橼酸钠和吐温80的水溶液，所述枸橼酸钠的浓度为0.05~0.2m，所述吐温80的浓度为5~10g/l。

7.根据权利要求3所述的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述轮状病毒保护剂各组分浓度为：谷氨酸钠0.3~0.8m、氯化锌5~15mm、氯化钙10~25mm、蔗糖2~2.5m。

8.根据权利要求3所述的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述轮状病毒保护剂与收获液的体积比为0.7~1.2:10。

9.根据权利要求3所述的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述高压均质进液速度10~20l/min，进液温度2~8℃，循环均质2~3次。

10.根据权利要求3所述的轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述料液温度为2~25℃，所述浓缩为进行5~10倍浓缩。

技术总结
本发明公开了一种轮状病毒保护剂及一种轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法。所述轮状病毒保护剂由谷氨酸钠、氯化锌、氯化钙、蔗糖溶解于注射用水制成，各组分浓度为：谷氨酸钠0.3~0.8M、氯化锌5~15mM、氯化钙10~25mM、蔗糖2~2.5M。所述轮状病毒减毒活疫苗原液制备方法包括：病毒培养；病毒收获，当50%~75%的细胞出现病变效应时，收集上清，再向病毒培养容器中加入细胞洗脱剂，收集脱落的细胞；向收获液中加入轮状病毒保护剂，采用高压均质方式破碎细胞；过滤超滤，即得轮状病毒减毒活疫苗原液。本发明方法制备的原液中病毒滴度高，杂质含量低，可在2~8℃长期保存；生产工艺流程周期短、生产效率高、生产成本低。

技术研发人员：杨晓明,白萱,王英,刘玉晴,石晨,阮波,刘生笙,谭臻,王祥,杨彪,左豪杰,唐义,郑嘉唯,姜志军,乔建,徐葛林,段凯,王泽鋆,张家友
受保护的技术使用者：武汉生物制品研究所有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15