一种长片段DNA捕获方法、试剂盒及其用途与流程

本申请涉及分子生物学领域，具体涉及一种长片段dna捕获方法、试剂盒及其用途。

背景技术：

1、液相杂交捕获技术在二代测序中有较多应用，即针对感兴趣的靶标基因设计单链dna或rna探针，该探针被生物素标记，通过与预先构建好的全基因组文库进行杂交，形成dna-dna或rna-dna杂交产物。随后，杂交产物会被带有链霉亲和素标记的磁珠捕获，通过洗脱走非特异性结合的文库后进行pcr扩增，获得含靶标区间的文库。最后，对获得的文库进行测序，从而分析靶标基因是否存在突变。

2、目前，市售的液相杂交捕获试剂盒主要针对二代测序应用，捕获文库主要是短片段dna(例如200bp-2000bp大小的dna)，难以捕获扩增得到更长的dna片段。

3、随着技术的发展，基于单分子测序技术的三代测序、基于纳米孔测序技术的四代测序，具有超长读长、高通量的特点，可直接对长片段dna进行检测。因此，本领域中需要对长片段dna进行捕获的新方法。

4、需要注意的是，在此部分中描述的方法不一定是之前已经设想到或采用的方法。除非另有指明，否则不应假定此部分中描述的任何方法仅因其包括在此部分中就被认为是现有技术。类似地，除非另有指明，否则此部分中提及的问题不应认为在任何现有技术中已被公认。

技术实现思路

1、基于此，为了获得长片段dna用于测序，本申请提供了一种长片段dna捕获方法，使用rna酶处理与rna探针杂交的长片段dna，其中所述长片段dna的长度不低于2kb，优选地，所述长片段dna的长度为4kb-10kb。本申请中的方法基于现有液相杂交捕获方法的基础上进行改进，通过加入rna酶进行消化，可以获得更长的dna片段，适用于搭载三代或四代测序平台进行靶基因测序分析。相对于现有方法获得的短片段dna，通过本申请中方法获得的长片段dna可充分保留原始基因组的信息，更有利于较复杂的融合基因类型的检出。

2、在一些实施方式中，在rna酶消化之后，还包括进行热变性的步骤。本申请中的方法在rna酶消化的基础上，进一步通过热变性的处理，两者协作使得长片段dna从捕获剂上得到更有效的解离，具有更高的长片段dna富集效率。

3、根据本申请的一种实施方式，可以提供一种用于实现本申请所述方法的试剂盒。

4、根据本申请的一种实施方式，可以提供一种用于长片段dna捕获的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：rna酶、rna探针、和/或捕获剂，其中所述长片段dna的长度不低于2kb，优选地，所述长片段dna的长度为4kb-10kb。

5、根据本申请的一种实施方式，可以提供一种根据本申请所述方法获得的长片段dna，或本申请所述的试剂盒在基因提取、基因分析、基因测序中的用途，优选地，所述基因测序包括三代测序、四代测序。

6、应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本申请的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本申请的范围。本申请的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。

1.一种长片段dna捕获方法，其特征在于，使用rna酶处理与rna探针杂交的长片段dna，

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述rna酶包括rnase a和/或rnase h，优选地，所述rna酶为rnase h。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述rna酶的用量不低于1u，优选地，所述rna酶的用量不低于5u。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述rna酶处理的温度为所述rna酶具有活性的任意温度，优选地，所述rna酶处理的温度不高于65℃，进一步优选地，所述rna酶处理的温度为37℃。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述rna酶处理的时间不低于20分钟，优选地，所述rna酶处理的时间为20分钟。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述rna探针带有亲和标记，优选地，所述亲和标记为生物素。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，在rna酶消化之后，还包括进行热变性的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述热变性的温度为80-100℃，优选地，所述热变性的温度为95℃。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述热变性的时间不低于30秒，优选地，所述热变性的时间为5分钟。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述热变性后进行瞬间降温处理。

12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其特征在于，在将长片段dna与rna探针杂交之前，还包括制备长片段dna文库的步骤：

13.一种用于长片段dna捕获的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：rna酶、rna探针、和/或捕获剂，

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述rna酶包括rnase a和/或rnase h，优选地，所述rna酶为rnase h。

15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述rna探针带有亲和标记，优选地，所述rna探针带有生物素。

16.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述捕获剂为磁珠，优选地，所述磁珠带有亲和标记，进一步优选地，所述磁珠带有链霉亲和素。

17.根据权利要求1-12任一项所述方法获得的长片段dna，或权利要求13-16任一项所述的试剂盒在基因提取、基因分析、基因测序中的用途，优选地，所述基因测序包括三代测序、四代测序。