体外维持肺泡Ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基的制作方法

本发明涉及肺泡ⅱ型上皮细胞培养，具体涉及一种体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基。

背景技术：

1、肺泡是肺组织中进行气-血交换的场所，肺泡腔面由两种上皮细胞构成：肺泡ⅰ型上皮细胞覆盖95%肺泡表面，是肺泡腔主要结构组成，该细胞很薄，利于气体通过，是肺泡腔和毛细血管内血液进行气体交换的部位；肺泡ⅱ型上皮细胞圆形或立方型，数量比ⅰ型上皮细胞多，散在于ⅰ型上皮细胞之间，对维持肺泡的正常气血交换功能具有重要的维持功能，包括分泌表面活性物质降低肺泡腔表面张力、修复受损肺泡上皮、调节肺水平衡和免疫防御作用。肺泡ⅱ型上皮细胞的修复功能不仅是可分裂增殖产生子代ⅱ型上皮细胞，而且可以分化为ⅰ型上皮细胞，因此ⅱ型上皮细胞通常被认为是肺泡上皮的干细胞。肺泡ⅱ型上皮细胞对肺发育、肺功能的调节、肺组织损伤修复以及在多种肺疾病的发生发展中均具有重要作用。

2、应用体外培养的肺泡ⅱ型上皮细胞开展研究，对认识肺泡的生理功能、病理生理状态、以及探索疾病治疗方法等具有重要意义。近年来，多项临床前研究均表明，肺泡ⅱ型上皮细胞在治疗急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等疾病方面也具有潜在应用前景。

3、不同于胚胎干细胞，作为一种成体组织来源的干细胞，肺泡ⅱ型上皮细胞在体外培养的过程中极易分化，丧失干性，并失去原有的细胞表型功能。一方面，体外培养的肺泡ⅱ型上皮细胞极易分化为肺泡ⅰ型上皮细胞，很快失去原有细胞的特性，不能满足多数实验的需求；另一方面，在体外细胞培养的过程中，肺泡ⅱ型上皮细胞的增殖能力随细胞的传代逐渐降低；此外，随细胞培养时间的延长，肺泡ⅱ型上皮细胞细胞表面标志物的表达逐渐丧失，主要功能包括磷脂的合成及分泌逐渐降低。由此不得不反复进行原代肺泡ⅱ型上皮细胞的分离培养，这样不仅增加了肺泡ⅱ型上皮细胞制备的成本，也严重影响和限制了肺泡ⅱ型上皮细胞的研究与应用。因此，如何维持和延长传代肺泡ⅱ型上皮细胞在体外培养过程中的表型及功能具有重要的科学意义和应用价值。

4、在体外原代培养过程中，肺泡ⅱ型上皮细胞在分离后贴壁培养48h即发生分化，失去干性及肺泡ⅱ型上皮细胞特征，为克服肺泡ⅱ型上皮细胞体外培养不稳定的问题，本领域技术人员尝试对肺泡ⅱ型上皮细胞的培养基进行改良，例如：遵义医学院陈淼课题组比较了不同培养基条件对大鼠肺泡ⅱ型上皮细胞表型维持的影响（蒲清瑚，体外培养大鼠肺泡ⅱ型上皮细胞表型维持方法的改良。硕士学位论文，遵义医学院，2018年），发现使用lonza公司的商品化sagm培养基，并添加1%胎牛血清（fbs）的效果优于含10% fbs或1%fbs的dmem组，也优于含10% fbs的sagm组，但该研究只在原代细胞上进行研究，未进行传代，并且sagm培养基价格昂贵；中国专利cn115786239a，公开日2023.03.14，公开了一种肺泡ⅱ型上皮细胞原代培养的方法，其中原代细胞的培养采用添加了20%fbs和2%ps的dmem/f12培养基，该公开的培养基明确针对原代细胞培养，传代后细胞是否仍能保持肺泡ⅱ型上皮细胞表型不可知；中国专利cn115873784a，公开日2023.03.31，公开了一种增强体外培养肺泡ⅱ型上皮细胞扩增能力的方法及其药物组合，细胞培养时使用dmem/f12培养基添加10%fbs、地塞米松和药物组合。该药物组合包括α2-肾上腺素受体拮抗剂-阿替美唑和α2-肾上腺素受体激动剂右美托咪定，发明者认为先后使用阿替美唑和右美托咪定处理肺泡ⅱ型上皮细胞，可以促进肺泡ⅱ型上皮细胞的增殖，并维持肺泡ⅱ型上皮细胞的干细胞性能，以及维持肺泡上皮细胞的表面活性物质分泌性能。添加组合药物的专利申请只提供了培养24小时的数据，尚不明确长期培养是否能维持肺泡ⅱ型上皮细胞的干性和表型。

5、综上所述，开发一种价格低廉，能够体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的培养基将具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是解决目前肺泡ⅱ型上皮细胞体外培养的困境，为解决该问题，本发明提供一种体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基，该培养基不仅可用于肺泡ⅱ型上皮细胞的原代培养，也可用于传代培养，适合体外长期和大规模培养肺泡ⅱ型上皮细胞，解决肺泡ⅱ型上皮细胞体外培养时细胞增殖问题、分化问题及肺泡ⅱ型上皮细胞特征迅速丧失问题。

2、作为一个具体的实施例，本发明提供了一种体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基，所述细胞培养基采用体外培养的一种人肿瘤干细胞系t3a-a3的条件培养基为主要成分，所述人肿瘤干细胞系t3a-a3于2009年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.3291。

3、优选的，所述人肿瘤干细胞系t3a-a3的条件培养基为含0-5%fbs的dmem/f12或dmem培养基。作为一些更具体的实施方式，根据细胞培养状态，添加的fbs量可以是0%、1%、2%、3%、4%、5%等，应该能理解的是，任何其他可培养t3a-a3的培养基如m199培养基、rpmi1640培养基、f12培养基、mem培养基等均可用于制备t3a-a3条件培养基，从而用于本发明体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基。

4、作为一些更具体的实施方式，一种体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基，采用体外培养的人肿瘤干细胞系t3a-a3的条件培养基为主要成分，根据肺泡ⅱ型上皮细胞的状态添加1-10%fbs组成，具体添加可以是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，可以促进原代肺泡ⅱ型上皮细胞的增殖，维持多次传代的肺泡ⅱ型上皮细胞的表型及功能。

5、采用本发明所述的细胞培养基培养肺泡ⅱ型上皮细胞，不仅促进肺泡ⅱ型上皮细胞的增殖，而且可以维持肺泡ⅱ型上皮细胞的干性及表型，维持磷脂的合成和分泌，满足了科学研究和应用开发对体外培养肺泡ⅱ型上皮细胞的需求。

6、本发明的第二个目的是提供一种体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基的制备方法，具体的包括以下步骤：

7、（1）将人肿瘤干细胞系t3a-a3在体外扩增培养，待细胞生长至汇合度80%以上时，更换含0-5%fbs的新鲜培养基；

8、（2）培养24小时后收集t3a-a3的培养上清液,并更换成与步骤（1）相同的新鲜培养基，所述上清液即t3a-a3的条件培养基；

9、（3）继续培养24小时，重复步骤（2）进行上清液收集和新鲜培养基更换；

10、（4）重复收集t3a-a3的上清液，并将各次收集的条件培养基混合，通过离心或过滤的方法去除细胞碎片等杂质，按照体积比例添加1-10%fbs，混合均匀后过滤除菌即制得体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基。

11、进一步，步骤（1）中，t3a-a3细胞的体外扩增培养方法为平面培养或3d培养。其中平面培养可以使用任何适合贴壁细胞培养的培养耗材，例如：培养皿、培养瓶、细胞工厂等；3d培养可以使用适合细胞3d培养的载体，例如：微载体、微载片等，使用这些载体进行t3a-a3细胞的扩增培养时，可以在转瓶或生物反应器等设备中进行。

12、由于人肿瘤干细胞系t3a-a3，该细胞体外增殖和存活能力非常强，在低血清条件下可较长时间维持良好状态，非常易于体外培养，所以使用该细胞的条件培养基作为主要成分来开发专用的细胞培养基时，生产工艺简单，质量容易控制，且成本低廉。

13、本发明的第三个目的是提供一种体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基及其制备方法的应用。

14、具体的可以应用在如下领域：

15、（1）原代肺泡ⅱ型上皮细胞增殖培养；

16、（2）传代肺泡ⅱ型上皮细胞增殖培养；

17、（3）抑制肺泡ⅱ型上皮细胞向肺泡ⅰ型上皮细胞分化；

18、（4）维持肺泡ⅱ型上皮细胞表面活性蛋白sp-a、sp-b、sp-c或sp-d的表达；

19、（5）维持多次传代的肺泡ⅱ型上皮细胞的干性；

20、（6）维持多次传代的肺泡ⅱ型上皮细胞的磷脂合成和分泌能力。

21、本发明所述的体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基可以用于分离的原代肺泡ⅱ型上皮细胞培养，也可用于肺泡ⅱ型上皮细胞传代培养。所述肺泡ⅱ型上皮细胞来源于哺乳动物，不局限于人类，其他种属的肺泡ⅱ型上皮细胞与人肺泡ⅱ型上皮细胞具有类似特征的哺乳动物肺泡ⅱ型上皮细胞均可适用，因此，本发明所述的细胞培养基也适用于其他种属如鼠、兔、绵羊或猪的肺泡ⅱ型上皮细胞的体外培养。

22、综上所述，本发明所提供的一种体外维持肺泡ⅱ型上皮细胞表型及功能的细胞培养基具有如下优点：（1）促进原代肺泡ⅱ型上皮细胞的增殖；（2）可维持多次传代的肺泡ⅱ型上皮细胞的表型及功能；（3）维持多次传代的肺泡ⅱ型上皮细胞的干性；（4）维持多次传代的肺泡ⅱ型上皮细胞的磷脂合成和分泌能力；（5）制备简单，价格低廉。

23、本发明所使用的人肿瘤干细胞系t3a-a3于2009年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区大屯路），保藏号为cgmcc no.3291，该细胞系已于2009年09月21日由保藏中心收到，并登记入册，根据请求，由该日起保存三十年，在期满前收到提供生物材料样品请求后再延续保存五年，该生物材料存活性经保藏中心检测结果为存活。