一种产β-石竹烯的霉菌及其选育方法和应用与流程

本发明涉及微生物，具体为一种产β-石竹烯的霉菌及其选育方法和应用。

背景技术：

1、据古籍记载：“清香型白酒，产于山西省汾阳县杏花村，距今已有约1400年的历史”。清香型白酒，又称汾香型白酒，代表酒为我国南方的湖北黄鹤楼酒和北方的山西汾酒。其又分为大曲清香型白酒与小曲清香型白酒。清香型白酒的酒体清亮透明，香气纯正，余味爽净，备受消费者欢迎。曲为“酒之骨”，好曲才能酿好酒，由于酒曲中含有丰富的微生物资源以及多种酶类，是酿造过程中微生物和酶类的主要来源，同时也是酒香、口感形成的关键，因此在白酒酿造中发挥着非常重要的作用。清香型白酒主要以大麦为原料，豌豆等辅料低温制曲，然后以高粱为原料，稻壳等为辅料，以低温大曲为糖化发酵剂，通过“清蒸二次清”工艺，以地缸固态发酵，甑桶蒸馏生产而成。

2、β-石竹烯是双环倍半萜型化合物，主要来源于植物和真菌的代谢过程。目前在多个领域都在研究其功能，在医药领域β-石竹烯具有抗菌、降血脂、抗炎、治疗结肠炎、抗高血压、抗肿瘤和杀菌活性，同时β-石竹烯也具有局部麻醉、消炎镇痛能力。目前，β-石竹烯的研究主要是在各类食用香精、重质松节油、积雪草等，对白酒和大曲中含有的β-石竹烯研究甚少，其来源也鲜有研究。呋喃类化合物也是很多中国白酒的重要功效成分，2-戊基呋喃具有豆香、果香、泥土、青香及类似蔬菜的香韵，可用于调配面包、坚果、咖啡及蔬菜香型的香精，但白酒中2-戊基呋喃的研究较少。

3、在目前研究中，专利cn202310202070.4公开了一种从美汉草中提取分离β-石竹烯的方法；专利cn202211591875.4公开了石竹烯和/或芳樟醇在防治稻瘟病中的应用；专利cn202110615577.3公开了一株产β-石竹烯的霉菌及其应用，属于横梗霉属,lichtheimiaramosa，保藏号为cctcc m 2021424，可应用于β-石竹烯强化麸曲的生产。虽然随着菌种筛选技术的不断成熟，菌种库的不断扩大，越来越多高产β-石竹烯菌种被进一步研究，但数量仍在少数，且存在菌种活力不稳定的问题，并且白酒中产β-石竹烯的菌种的研究较少，值得深入探讨。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种产β-石竹烯的霉菌，菌株为戴尔根霉，分类命名为rhizopus delemar hhl-003，菌株号为hhl-003，菌落大、菌落形态初期为白色，后期为黑灰色，有孢子，菌丝干燥。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctcc m 2023879，保藏时间为2023.5.30。

2、本发明还提供了一种产β-石竹烯的霉菌的选育方法，该方法具体步骤如下：

3、s1：将清香型白酒大曲粉碎混合均匀后，取样10g溶于90ml无菌生理盐水中制为10-1菌悬液；

4、s2：将其稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分别涂布于sda培养基中；

5、s3：在30℃培养箱中培养48h，观察培养基上菌落形态，挑取合适单菌落划线纯化，在30℃培养箱中培养48h，得到单菌落；

6、s4：将霉菌菌种制作为孢子悬浮液，接种于麸皮培养基中，于30℃培养箱内培养3d，每隔12h扣瓶一次，后续使用hs-spme和gc-ms联用法检测麸曲中β-石竹烯和2-戊基呋喃，采用gc法对β-石竹烯以及2-戊基呋喃进行定量。

7、优选的，s3中培养基成分为蛋白胨2.5g，葡萄糖10g，琼脂5g，蒸馏水250ml。

8、优选的，s4中孢子悬浮液制备方法为：取纯种菌株斜面一支，加入5ml灭菌后的0.9％生理盐水(含0.1％吐温20)，将其孢子冲入已灭菌且装有玻璃珠的空三角瓶中，在30℃摇床下放置30min，用四层纱布过滤，利用血球计数板计数后，将孢子悬浮液稀释至10-6-10-7。

9、优选的，s4中麸皮培养基成分为细麸皮100g，蒸馏水70ml。

10、本发明还提供了一种产β-石竹烯的霉菌在发酵中生产β-石竹烯的应用，强化麸曲中β-石竹烯浓度为37.97mg/l，2-戊基呋喃浓度为2.56mg/l。

11、本发明还提供了一种产β-石竹烯的霉菌在小坛发酵中的应用，对白酒香气成分分析，对照组中β-石竹烯含量和2-戊基呋喃含量分别1.56mg/l和0.69mg/l，强化组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量增加到了2.76mg/l和1.21mg/l，增强了酒体风味与品质。

12、本发明还提供了一种产β-石竹烯的霉菌在地缸中扩大培养中的应用，对白酒香气成分分析，对照组中β-石竹烯含量和2-戊基呋喃浓度分别1.20mg/l和0.54mg/l，强化组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量增加到了2.00mg/l和0.82mg/l，增强了酒体风味与品质。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过实验室平板实验和强化麸曲挥发性香气成分检测实验结果显示有22种挥发性成分包括白酒健康因子β-石竹烯37.97mg/l、2-戊基呋喃2.56mg/l，hhl-003糖化酶活为1357.94u/(g干曲)、液化酶活为0.029u/(g干曲)和酯化酶活为40.418u/(g干曲)。在后续功能强化小坛发酵应用中rhizopus delemar组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量较空白组分别提高了76.92％和75.36％，在地缸的扩大培养中趋势与小坛发酵相同，结果表明该菌株不仅提高了高粱酒醅中的挥发性组分与功能性成分，且有良好应用前景。

技术特征：

1.一种产β-石竹烯的霉菌，其特征在于：菌株为戴尔根霉，菌株号为hhl-003，菌落大、菌落形态初期为白色，后期为黑灰色，有孢子，菌丝干燥。

2.一种根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌的选育方法，其特征在于：该方法具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的一种产β-石竹烯的霉菌的选育方法，其特征在于：s3中培养基成分为蛋白胨2.5g，葡萄糖10g，琼脂5g，蒸馏水250ml。

4.根据权利要求2所述的一种产β-石竹烯的霉菌的选育方法，其特征在于：s4中孢子悬浮液制备方法为：取纯种菌株斜面一支，加入5ml灭菌后的0.9％生理盐水，将其孢子冲入已灭菌且装有玻璃珠的空三角瓶中，在30℃摇床下放置30min，用四层纱布过滤，利用血球计数板计数后，将孢子悬浮液稀释至10-6-10-7。

5.根据权利要求2所述的一种产β-石竹烯的霉菌的选育方法，其特征在于：s4中麸皮培养基成分为细麸皮100g，蒸馏水70ml。

6.一种根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌在发酵中生产β-石竹烯的应用，其特征在于：强化麸曲中β-石竹烯浓度为37.97mg/l，2-戊基呋喃浓度为2.56mg/l。

7.一种根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌在小坛发酵中的应用，其特征在于：对白酒香气成分分析，对照组中β-石竹烯含量和2-戊基呋喃含量分别1.56mg/l和0.69mg/l，强化组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量增加到了2.76mg/l和1.21mg/l，增强了酒体风味与品质。

8.一种根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌在地缸中扩大培养中的应用，其特征在于：对白酒香气成分分析，对照组中β-石竹烯含量和2-戊基呋喃浓度分别1.20mg/l和0.54mg/l，强化组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量增加到了2.00mg/l和0.82mg/l，增强了酒体风味与品质。

技术总结
本发明公开了一种产β‑石竹烯的霉菌及其选育方法和应用，其分类命名为戴尔根霉(Rhizopus delemar)，保藏号为：CCTCC M 2023879，菌株号为Rhizopus delemar HHL‑003。本发明的产β‑石竹烯的戴尔根霉HHL‑003通过实验室平板实验和强化麸曲挥发性香气成分检测实验结果显示有22种挥发性成分包括白酒健康因子β‑石竹烯37.97mg/L、2‑戊基呋喃2.56mg/L，HHL‑003糖化酶活为1357.94U/(g干曲)、液化酶活为0.029U/(g干曲)和酯化酶活为40.418U/(g干曲)。在后续功能强化小坛发酵应用中Rhizopus delemar组β‑石竹烯和2‑戊基呋喃含量较空白组分别提高了76.92％和75.36％，在地缸的扩大培养中趋势与小坛发酵相同，结果表明该菌株不仅提高了高粱酒醅中的挥发性组分与功能性成分，且有良好应用前景。

技术研发人员：李良,牟飞燕,董孝元,方尚玲,李俊薇,许鹏
受保护的技术使用者：黄鹤楼酒业（咸宁）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15