选择和使用褪黑素支持细菌以减少婴儿绞痛的制作方法

本发明在本文中提供了某些乳酸菌菌株、选择此类菌株的方法、以及含有此类菌株的产品，所述菌株因其增加褪黑素水平用于预防和/或治疗绞痛(或与褪黑素的水平减少有关的其它疾病)的能力而加以选择，所述能力包括产生褪黑素前体和关于褪黑素释放的其它重要组分的能力。此外，本发明涉及包含底物组分的制剂，所述底物组分特别选择为增强此类菌株的功效。

背景技术：

1、尽管婴儿绞痛在患病率和痛苦两个方面均非常突出，但其性质和原因仍然知之甚少。还存在用于描述该病况的不同术语。这些术语包括“婴儿绞痛”、“夜晚绞痛”(因为疼痛主要限于夜晚)和“三个月绞痛”(说辞是它在出生后约三个月后消失)。不同的作者已使用了不同的定义。wessels的定义在文献中已被广泛接受，其为绞痛是在至少三周时期的过程中，每天哭泣三个或更多个小时，每周持续三天或更多天的发作。在2006年公布的rome iii标准修改了这一标准，认为“婴儿绞痛”的诊断适用于具有易怒、焦躁或哭泣的发作的婴儿，所述发作无明显原因而起始且停止，每天持续3个或更多个小时且每周发生至少3天，但持续至少1周(有时称为修改的wessel标准)。在rome iv标准中进一步微调；(benninga等人；gastroenterology 2016；150:1443–1455)。这些定义中的任一者(rome iii或rome iv)都与本发明相关。

2、迄今为止，婴儿绞痛的主要讨论的可能病因已分成：社会心理，胃肠道，包括微生物生态失调和神经发育障碍。

3、社会心理因素包括：正常哭泣的变型，非典型父母教养方式的行为影响，以及父母-婴儿互动中的问题表现。

4、胃肠道病症已牵涉绞痛，因为婴儿在哭泣时间内的腿部姿势和痛苦表情。胃肠道因素在下文简要综述：

5、不正确的喂养技术如奶瓶喂养、平卧位喂养，以及喂养后没有拍嗝(burping)已被视为诱发因素。已发现前六个月中的母乳喂养是保护性因素。婴儿绞痛的风险在非母乳喂养的婴儿中是1.86倍(saavedra ma，dacosta js，garcias g，horta bl，tomasi e，mendocar.infantilecolic incidence and associated risk factors:a cohort study.pediatr(rio j)2003；79(2):115-122)。

6、目前不存在绞痛的完全治愈。绞痛的当前治疗范例由药理学方法和/或非药理学方法组成，充其量提供了症状的减轻。提供给父母的关于绞痛的典型治疗干预措施落入四个范畴，包括饮食、身体、行为和药理学。饮食管理包括关于各种喂养技术的专业建议，或使用低变应原性乳、不含大豆或乳糖的配方、食物补充剂(如各种益生菌和益生元)以及固体食物的早期引入。

7、用于绞痛治疗的非处方药疗法在很大程度上已包括二甲基硅油或二甲基聚硅氧烷(不可吸收的非处方药)的施用，其减少肠道气泡的大小。尽管几项研究证实二甲基硅油对婴儿绞痛的有效性并不比安慰剂好，但二甲基硅油具有安全性概况且被频繁推荐。

8、已有一些报道暗示在绞痛婴儿中改变的微生物群模式，使得几名研究人员进行且发表了不同的随机化临床对照试验(rct)，其中已评估了例如罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)dsm 17938减少这些婴儿中的哭泣时间的能力。例如，savino等人(pediatrics2010；126:e526–33)在2010年进行了rct，以测试这种菌株对婴儿绞痛的功效。根据修改的wessel标准诊断的50个纯母乳喂养的绞痛婴儿，被随机分配为每天接受罗伊氏乳杆菌dsm 17938(108个菌落形成单位)或安慰剂持续21天。父母问卷调查监测了每天的哭泣时间和不良反应。46个婴儿(罗伊氏乳杆菌组：25个；安慰剂组：21个)完成了试验。在第0天时，以分钟/天计(中值)的每日哭泣时间为370相对于300，而在第21天时，则为35.0相对于90.0(p＝.022)。

9、在2013年，szajewska等人(j pediatr 2013；162:257–62)发表了在年龄<5个月的80个婴儿中具有类似设计的rct，鉴定了与安慰剂组相比，对治疗的应答者比率在益生菌组中显著更高。分钟/天(中值)在第7天时为180相对于180，在第14天时为75相对于128，而在第21天时为52相对于120(p<0.05)。还存在几项其它研究，其显示了罗伊氏乳杆菌dsm17938在绞痛婴儿中显著减少母乳喂养婴儿中的哭泣时间的效应。然而，存在关于以更高比率减少绞痛儿童，包括以更高比率减少配方喂养儿童中的哭泣的甚至更有效干预措施的需要。

10、因此，当前需要新的(并且优选地改进的)安全有效的化合物和组合物和技术，其证明对于治疗婴儿中的绞痛有用。本发明的组合物和方法响应了这一需要，提供了可以安全有效地预防且治疗婴儿中的绞痛(或与绞痛有关的症状)的产品。

11、其它目的和优点根据下述公开内容将是更显而易见的。

技术实现思路

1、新生儿激素不成熟被暗示为肠动力发育的早期问题中的主要因素，并且因此也引起婴儿例如婴儿绞痛中的疼痛和哭泣。褪黑素是一种激素，其具有支持生物节律的能力，并且对人和动物中的许多功能具有重要作用。褪黑素的前体是5-羟色胺，一种本身可以来源于氨基酸色氨酸的神经递质。

2、褪黑素是先前被认为占优势地由松果体分泌的神经递质。然而，存在褪黑素产生的松果体外部位，例如视网膜和胃肠道。

3、小婴儿中的5-羟色胺和褪黑素产生和不同昼夜节律之间的同步以及随后释放，对避免肠动力紊乱和疼痛例如婴儿绞痛(ic)是潜在地重要的。

4、5-羟色胺增加肠道平滑肌收缩，而褪黑素使肠道平滑肌松弛。如果不被其它试剂(褪黑素是其中重要的一种)平衡，则5-羟色胺浓度峰值可以引起肠痛性痉挛。5-羟色胺和褪黑素两者均具有昼夜节律。虽然在婴儿出生时存在产生的5-羟色胺和发展的5-羟色胺昼夜节律，但内源性褪黑素产生和褪黑素昼夜节律在许多婴儿中直到出生第三个月后才开始准备好。这个时间与婴儿绞痛的正常消失时间相一致。

5、可以说婴儿绞痛是褪黑素缺乏的病况。因此，已建议给予患有ic的婴儿外源性褪黑素，但许多医生和父母都不愿给予婴儿激素。

6、在所有新生儿中，存在估计为5％至25％的ic患病率，这在几个方面对于社会、父母和婴儿本身是累赘和高成本的。

7、因此，尽管一些儿童似乎能够由其食物和/或其肠道细菌产生且释放所需的褪黑素，并且因此不太可能发展婴儿绞痛，但仍有许多儿童不是这样，并且因此需要额外的支持来预防或治疗ic。

8、因此，需要寻找且开发产品和方法，以支持处于发展ic或患有ic的风险中的儿童中的褪黑素产生和释放。

9、本发明基于以下发现：可以选择能够产生腺苷的细菌，例如乳酸菌。产生腺苷的乳酸菌在本领域中尚未得到报道，并且此类细菌可以例如用于增加褪黑素合成中的限速酶，芳烷基胺-n-乙酰基转移酶(aanat)的产生。尽管aanat酶在松果体中发现，但它也在褪黑素产生的松果体外部位例如胃肠道中产生。因此，aanat产生中的增加(例如，经由腺苷产生中的增加)提供了增加胃肠道中的褪黑素产生、或增加褪黑素水平的手段。因此，此类细菌可以用于治疗或预防婴儿绞痛或其它疾病，所述其它疾病与褪黑素产生或合成减少、低或不足有关，或者以其为特征。

10、因此，本发明提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株，其能够产生腺苷或诱导腺苷产生，用于受试者中的腺苷产生(例如，增加腺苷水平或者增加或促进腺苷的产生)、或用于受试者中的褪黑素产生(例如，增加褪黑素水平或者增加或促进褪黑素的产生)。

11、本发明进一步提供了用于在受试者中产生腺苷或褪黑素(例如，增加腺苷或褪黑素的水平、或者增加或促进腺苷或褪黑素的产生)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细菌菌株，例如乳酸菌菌株的步骤，所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生。

12、本发明进一步提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造药物或组合物中的用途，所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，所述药物或组合物用于在受试者中产生腺苷或褪黑素(例如，增加腺苷或褪黑素的水平、或者增加或促进腺苷或褪黑素的产生)。

13、更一般地来看，本发明还提供了能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的细菌，例如乳酸菌。此类细菌因此可以用于在受试者中产生褪黑素，例如用于增加褪黑素的产生或水平。

14、因此，在一个方面，本发明提供了能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的乳酸菌菌株，其用于在受试者中产生褪黑素(例如，增加褪黑素的水平、或者增加或促进褪黑素的产生)。

15、在另一个方面，本发明提供了在受试者中产生褪黑素(例如，增加褪黑素的水平、或者增加或促进褪黑素的产生)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的乳酸菌菌株的步骤，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生。

16、在另一个方面，本发明提供了乳酸菌菌株在制造药物或组合物中的用途，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生，所述药物或组合物用于在受试者中产生褪黑素(例如，增加褪黑素的水平、或者增加或促进褪黑素的产生)。

17、如上文讨论的，此类菌株可以用于治疗或预防婴儿绞痛或其它疾病，所述其它疾病与褪黑素产生或合成或水平减少、低或不足有关，或者以其为特征。

18、因此，本发明进一步提供了用于在治疗或预防受试者中的婴儿绞痛或其它疾病中使用的乳酸菌菌株，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生，所述其它疾病与褪黑素产生或合成或水平减少、低或不足有关，或者以其为特征。

19、在另一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者中的婴儿绞痛或其它疾病的方法，所述其它疾病与褪黑素产生或合成或水平减少、低或不足有关，或者以其为特征，所述方法包括向所述受试者施用有效量的乳酸菌菌株的步骤，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生。

20、在另一个方面，本发明提供了乳酸菌菌株在制造药物或组合物中的用途，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生，所述药物或组合物用于治疗或预防受试者中的婴儿绞痛或其它疾病，所述其它疾病与褪黑素产生或合成或水平减少、低或不足有关，或者以其为特征。

21、如本文其它地方所述，此类菌株可能能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，且从而产生褪黑素或诱导褪黑素的产生(例如下游产生)。

22、本发明的其它目的和优点对于读者将变得显而易见，并且预期这些目的和优点在本发明的范围内。

23、本发明涉及以下实施方案

24、1.一种能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的乳酸菌菌株，其用于在受试者中产生褪黑素。

25、2.用于实施方案1的用途的菌株，其中所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生。

26、3.实施方案1或实施方案2的菌株，其中所述乳酸菌菌株具有编码5'-核苷酸酶的基因、或具有活性5'-核苷酸酶。

27、4.用于实施方案1至3中任一项的用途的菌株，其中所述菌株具有大于2单位/l或8单位/l的5'-核苷酸酶活性，和/或能够以大于2μmol l-1分钟-1或8μmol l-1分钟-1的水平产生腺苷或诱导其产生，和/或能够产生其水平为大于10或20pg/ml的褪黑素或诱导其产生。

28、5.用于实施方案1至4中任一项的用途的菌株，其中所述用途是治疗或预防与褪黑素缺乏或减少有关的疾病。

29、6.用于实施方案1至5中任一项的用途的菌株，其中所述用途是治疗或预防婴儿绞痛。

30、7.用于实施方案1至6中任一项的用途的菌株，其中所述受试者是多至12个月龄，优选多至6或5个月龄，或优选多至3或4个月龄的婴儿；和/或其中所述受试者是母乳喂养的或用配方奶喂养的或其组合。

31、8.用于实施方案1至7中任一项的用途的菌株，其中所述用途是治疗或预防肠易激综合征(ibs)、睡眠障碍或神经变性疾病，优选阿尔茨海默病或其它类型的痴呆。

32、9.用于实施方案1至8中任一项的用途的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)，优选地其中所述菌株不是罗伊氏乳杆菌dsm 17938。

33、10.用于实施方案1至9中任一项的用途的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌dsm32846、dsm 32847、dsm 32848、dsm 32849和/或dsm 33198。

34、11.用于实施方案1至10中任一项的用途的菌株，其中所述菌株具有5'-核苷酸酶活性，和/或能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，和/或能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生，其水平与罗伊氏乳杆菌dsm 17938相比是增加的。

35、12.用于实施方案1至11中任一项的用途的菌株，其中所述用途进一步包括施用至少一种另外的试剂，优选地，其中所述另外的试剂是amp或amp的来源。

36、13.一种能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的乳酸菌菌株，其中所述菌株不是罗伊氏乳杆菌dsm 17938。

37、14.一种乳酸菌菌株或实施方案13的菌株，其中所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，其中所述菌株不是罗伊氏乳杆菌dsm 17938。

38、15.实施方案13或实施方案14的菌株，其中所述菌株具有编码5'-核苷酸酶的基因、或具有活性5'-核苷酸酶。

39、16.实施方案13至15中任一项的菌株，其中所述菌株具有大于2单位/l或8单位/l的5'-核苷酸酶活性，和/或能够以大于2μmol l-1分钟-1或8μmol l-1分钟-1的水平产生腺苷或诱导其产生，和/或能够产生其水平为大于10或20pg/ml的褪黑素或诱导其产生。

40、17.实施方案13至16中任一项的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌，优选罗伊氏乳杆菌dsm 32846、dsm 32847、dsm 32848、dsm 32849或dsm 33198。

41、18.一种细菌菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌dsm 32846、dsm 32847、dsm32848、dsm 32849或dsm 33198。

42、19.实施方案18的菌株，其用于疗法中。

43、20.实施方案18或实施方案19的菌株，其中所述菌株用于治疗或预防婴儿绞痛。

44、21.实施方案18或实施方案19的菌株，其中所述菌株用于治疗或预防肠易激综合征(ibs)、睡眠障碍或神经变性疾病，优选阿尔茨海默病或其它类型的痴呆。

45、22.实施方案13至21中任一项的菌株在用于生产褪黑素的方法中的用途，或实施方案14至21中任一项的菌株在用于生产腺苷的方法中的用途。

46、23.实施方案22的用途，其中通过所述菌株产生的腺苷被转化为褪黑素。

47、24.一种用于选择能够产生腺苷的乳酸菌菌株的方法，其中所述方法包括：

48、a)对于编码5'-核苷酸酶的基因的存在，筛选乳酸菌菌株；和/或

49、b)对于活性5'-核苷酸酶的存在，筛选乳酸菌菌株或其上清液；和

50、c)选择能够产生腺苷的菌株；以及任选地

51、d)培养或繁殖此类菌株。

52、25.实施方案24的方法，其中对于以下选择所述菌株：具有大于2单位/l的5'-核苷酸酶活性和/或能够以大于2μmol l-1分钟-1的水平产生腺苷，优选地具有大于8单位/l的活性和/或能够以大于8μmol l-1分钟-1的水平产生腺苷。

53、26.实施方案24至25中任一项的方法，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌。

54、27.一种通过实施方案24至26中任一项的方法选择的乳酸菌菌株，其中所述菌株能够产生腺苷。

55、28.实施方案27的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌dsm 32846、dsm 32847、dsm32848、dsm 32849或dsm 33198。

56、29.一种通过根据实施方案24至26中任一项的方法选择的菌株，其中所述乳酸菌菌株具有编码5'-核苷酸酶的基因、或具有活性5'-核苷酸酶，并且能够产生腺苷，所述乳酸菌菌株用于在受试者中产生腺苷，或用于在受试者中产生褪黑素，优选地其中所述用途如实施方案5至8中任一项中限定的。

57、30.一种适合于增加受试者中的褪黑素或腺苷产生的组合产品，其包含：

58、(i)能够产生褪黑素或腺苷或者诱导褪黑素或腺苷的产生的第一乳酸菌菌株；和

59、(ii)褪黑素和/或腺苷的另外的来源，或者增加或增强通过所述乳酸菌菌株的褪黑素和/或腺苷产生或诱导的一种或多种底物组分或试剂，

60、优选地其中所述菌株如实施方案13至18中任一项中限定的，和/或其中所述底物组分是amp或amp的来源。

61、31.一种在受试者中产生褪黑素的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的乳酸菌菌株的步骤，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生。

62、32.乳酸菌菌株在制造用于在受试者中产生褪黑素的药物或组合物中的用途，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生。

63、33.实施方案31或实施方案32的方法或用途，其治疗所述受试者中选自以下的疾病：婴儿绞痛、肠易激综合征(ibs)、睡眠障碍和神经变性疾病，优选阿尔茨海默病或其它类型的痴呆。

64、34.实施方案31至33中任一项的方法或用途，其中所述菌株或所述疾病或所述受试者或所述施用如实施方案2至18中任一项中限定的。