一种基于酰肼类衍生物用于Cu2+和草甘膦定向识别的荧光化合物

本发明涉及有机小分子荧光探针，具体为一种基于酰肼类衍生物用于cu2+和草甘膦定向识别的荧光化合物。

背景技术：

1、微量元素cu2+在生物体中具有重要的生理功能，参与细胞呼吸、骨形成和神经功能调节等多种基本生理过程，缺乏cu2+可能增加罹患冠心病等疾病的风险；然而，超载的cu2+对环境产生毒性和有害性，可能引发一系列疾病，并取代其他金属离子作为各种辅助因子；与阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病、威尔逊病和家族性肌萎缩侧索硬化症等疾病也有相关性；鉴于cu2+的重要性及其与多种疾病的关联，发展高选择性、灵敏、快速的cu2+化学传感器变得至关重要；此类传感器可以用于检测体内和环境中的cu2+浓度，为疾病的早期诊断和治疗提供指导，并在环境监测中发挥重要作用；目前，针对cu2+的光学检测方法已经提出了多种信号机制；其中，基于cu2+顺磁性特征的荧光猝灭探针成为研究热点；一些具有席夫碱结构的有机荧光分子和闭饱和螺环结构的罗丹明及其他荧光探针，因其能够探测cu2+并在其存在下发生荧光增强而备受关注；此外，比色或"关闭"荧光探针的设计和开发也在不断进行，为cu2+的检测提供了可行的方案；然而，在cu2+荧光探针的研究中，仍存在一些挑战；例如，传感器的选择性、灵敏度和响应速度需要进一步改进，以满足临床和环境应用的需求；此外，明显的吸收光谱偏移和覆盖可见区域的颜色变化将是更理想的检测方式，有助于实现快速、直观的cu2+检测；因此，为了开发高效的cu2+化学传感器，需要选择适当的信号机制，并注意探针的选择性、灵敏度和响应速度；覆盖可见区域的明显颜色变化将是一种理想的检测方式；

2、草甘膦是一种广泛应用于农业领域的除草剂，被广泛用于控制杂草和提高农作物产量；然而，草甘膦的大量使用也引发了环境和健康方面的关注；由于其在土壤中缓慢降解，草甘膦残留物可能会渗入地下水和水域，对生态系统造成潜在风险；为此，美国环保局将饮水中的草甘磷上限设定为0.7μg/ml；欧洲联盟对大部分农作物中的最大浓度是0.1μg/ml，对果实中的最大浓度是0.5μg/g；根据国家标准，饮用水中草甘膦的最高浓度限额为0.7μg/ml，在果实中的最高浓度限额为0.1μg/g；如何对其进行快速、便捷的检测是当前亟待解决的问题；因此，开发有效的草甘膦检测方法至关重要；传统的草甘膦检测方法通常依赖于昂贵的仪器设备和复杂的分析过程，限制了其在现场和快速检测中的应用；而荧光探针作为一种快速、灵敏、非破坏性的检测方法，近年来备受研究关注；荧光探针可以通过与草甘膦分子发生特异性的相互作用来实现检测；这些探针在存在草甘膦时会产生荧光信号的变化，从而实现对草甘膦的快速检测；由于草甘膦具有特定的化学结构和荧光猝灭能力，设计和合成荧光探针来与其相互作用，已成为研究的热点领域；通过开发高选择性、高灵敏度和响应迅速的荧光探针，可以实现对草甘膦在农作物、土壤和水体中的迅速监测和定量分析；这将有助于及时评估农田施用草甘膦的效果和环境风险，从而采取相应的控制措施，保护环境和人类健康；

3、综上，合成了基于酰肼类衍生物为荧光母体的新型定向识别cu2+和草甘膦的荧光化合物(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼；该荧光化合物利用丙二酸二乙酯以及水合肼对4-二乙氨基苯甲醛进行修饰，提高其灵敏度及加大斯托克位移，有望开发出能够可特异性定向识别cu2+和草甘膦并可应用于细胞和活体组织成像的荧光化合物；因此，有必要提供一种基于酰肼类衍生物用于cu2+和草甘膦定向识别的荧光化合物解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明要解决的第一个技术问题是开发出一种抗干扰能力强且可特异性定向识别cu2+和草甘膦的荧光化合物，该荧光化合物可区分cu2+和草甘膦与其他分析物。

2、本发明要解决的第二个技术问题是提供一种可特异性定向识别cu2+和草甘膦的荧光化合物的制备方法。

3、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于酰肼类衍生物用于cu2+和草甘膦定向识别的荧光化合物，包括荧光化合物为(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼，其化学结构式如式(i)所示：

4、

5、基于酰肼类衍生物用于cu2+和草甘膦定向识别的荧光化合物的制备方法，操作步骤如下：

6、步骤(1)：由4-二乙氨基苯甲醛、丙二酸二乙酯和吡咯烷在乙醇中反应制备得到7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-铬烯-3-羧酸乙酯；

7、步骤(2)：由7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-铬烯-3-羧酸乙酯经过水合肼修饰制备得到7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼；

8、步骤(3)：由7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼和4-二乙氨基苯甲醛在冰乙酸的作用下制备得到(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼。

9、步骤1中7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-铬烯-3-羧酸乙酯的制备方法，其步骤如下：

10、a、先将6.03g的4-二乙氨基苯甲醛，5.95g的丙二酸二乙酯溶解在装有120ml乙醇溶液的250ml三口瓶中；

11、b、接着向上述混合溶液中添加0.5ml的吡咯烷搅拌回流,tlc监测反应进程；

12、c、然后反应完成后将反应液缓慢倒入240ml水中，有大量固体析出，过滤并水洗，干燥得到7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-铬烯-3-羧酸乙酯。

13、步骤2中7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼的制备方法，其步骤如下：

14、a、先通过四氢呋喃作为溶剂将3.48g的7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-铬烯-3-羧酸乙酯和3.06g的80％水合肼溶解并混合均匀；

15、b、接着对溶液在回流搅拌6小时后用旋转蒸发器除去溶剂，然后使用乙醇重结晶得到7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼。

16、步骤3中(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼的制备方法，其步骤如下：

17、a、在250ml三口瓶中将1.06g的7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼、4-二乙氨基苯甲醛以及冰乙酸0.5ml混合溶解在100ml无水乙醇中；

18、b、上述混合溶液在回流反应15小时后冷却至室温，接下来过滤干燥后使用n，n-二甲基甲酰胺重结晶，得到(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼。

19、式(i)中，用于溶液体系中荧光化合物对cu2+和草甘膦的定向识别影响因素和筛选方法，其步骤如下：

20、a、荧光化合物用不同溶剂配制成浓度为10μm的工作溶液，所述7种溶剂分别为二甲基亚砜、n，n-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯；向所述不同溶剂配制好的10μm的荧光化合物溶液中依次对应加入100μmcu2+和草甘膦，每种溶剂设置三个重复实验；反应完全，得到21份不同溶剂作为工作溶液的荧光化合物与cu2+的反应溶液和21份荧光化合物-cu2+体系与草甘膦的反应溶液，共42份反应溶液，分别对上述42份反应溶液进行荧光强度测定，荧光化合物检测cu2+和草甘膦体系中使用二甲基亚砜，最后选择二甲基亚砜为溶剂检测cu2+和草甘膦；

21、b、荧光化合物用不同比例的二甲基亚砜与4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制成浓度为10μm的荧光化合物溶液，所述二甲基亚砜比例分别为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％；向使用不同比例二甲基亚砜配制好的10μm的荧光化合物溶液中分别依次加入100μm cu2+和草甘膦，不同比例的二甲基亚砜作为工作溶液的实验每组设置三个重复实验；反应完全，得到27份不同比例二甲基亚砜作为工作溶液的荧光化合物与cu2+的反应溶液和27份荧光化合物-cu2+体系与草甘膦的反应溶液，共54份反应溶液，分别对54份反应溶液进行荧光强度测定，测定结果为荧光化合物检测cu2+和草甘膦体系中4-羟乙基哌嗪乙磺酸与二甲基亚砜比例为3:7；

22、c、荧光化合物用缓冲液配制成浓度为10μm的荧光化合物溶液，所述cu2+和草甘膦检测体系工作液由体积比为3:7的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和二甲基亚砜配制成；设置缓冲溶液ph为2，3，4，5，6，6.5，7，7.4，8，9，10，11，12；向不同ph浓度为10μm的荧光化合物溶液中分别依次加入100μm cu2+和草甘膦，工作溶液的不同ph实验每组设置三个重复；反应完全，得到39份不同ph的荧光化合物与cu2+的反应溶液和39份不同ph的荧光化合物-cu2+体系与草甘膦的反应溶液，共78份反应溶液，分别对78份反应物进行荧光强度测定，测定结果为cu2+和草甘膦检测体系的最适ph在5-10范围内。考虑到后续在生物体内进行成像实验，因此选择生理ph为7.4作为后续实验溶液的ph。

23、式(i)中荧光化合物的应用，所述荧光化合物作为荧光探针，用于定向识别cu2+和草甘膦。

24、所述荧光化合物的应用，其步骤如下：

25、a、用于环境溶液介质中cu2+和草甘膦的定向识别，将所述荧光化合物配制成浓度为10μm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和二甲基亚砜缓冲液；

26、b、所述缓冲液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸和二甲基亚砜的体积比为3:7，缓冲液的ph值为7.4；

27、c、向配制好的10μm的荧光探针溶液中分别加入100μm的分析物溶液，包括生物体内常见的以下金属离子：硫酸铜，氯化铁，氯化钾，氯化镍，氯化钙，氯化汞，氯化钠，氯化镁，氯化钴，氯化锰，氯化钡和氯化锌；

28、d、环境中类似结构农药为：丙溴磷，草甘膦，哒螨灵，敌克松，二嗪农，喹硫磷，马拉硫磷，丙硫磷，辛硫磷，反应完全后进行荧光强度测定；

29、e、通过对荧光强度变化的研究，测定结果为该荧光探针可以与cu2+和草甘膦进行定向识别反应产生显著的荧光变化，即所述荧光化合物可以特异性定向识别cu2+和草甘膦。

30、所述荧光化合物的应用，其步骤如下：

31、用于检测人体宫颈癌组织hela细胞中cu2+和草甘膦分布时，将所述荧光化合物配制成浓度为20μm的缓冲液，并分为a，b，c，d，e，f共六组：

32、a组(空白对照)：未被任何处理的hela细胞，作为a组检测物；

33、b组(cu2+对照)：用50μm的cu2+孵育hela细胞30分钟，作为b组检测物；

34、c组(草甘膦对照)：用50μm的草甘膦孵育hela细胞30分钟，作为c组检测物；

35、d组(荧光化合物对照)：用(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼(20μm)孵育hela细胞30分钟，作为d组检测物；

36、e组(实验组1)：将hela细胞用cu2+(50μm)处理30min后，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液洗涤3次去除多余的cu2+，再用探针溶液(20μm)处理30min，作为e组检测物；

37、f组(实验组2)：将hela细胞用cu2+(50μm)处理30min后，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液洗涤3次去除多余的cu2+，再用20μm的探针溶液处理30min，最后用50μm的草甘膦处理30min，作为f组检测物；

38、通过a，b，c，d，e，f组荧光成像结果显示20μm的(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼能够进入细胞中，并与细胞中的cu2+和草甘膦进行反应，细胞成像能够很明显的看出cu2+和草甘膦在细胞中的分布情况。

39、所述的荧光化合物的应用，其步骤如下：用于斑马鱼中cu2+和草甘膦检测时，将所述荧光化合物配制成浓度为20μm的工作液；并分为a，b，c，d，e，f六组：

40、a组(空白对照)：未被任何处理的三日龄斑马鱼，作为a组检测物；

41、b组(cu2+对照)：用50μm的cu2+孵育三日龄斑马鱼30分钟，作为b组检测物；

42、c组(草甘膦对照)：用50μm的草甘膦孵育三日龄斑马鱼30分钟，作为c组检测物；

43、d组(荧光化合物对照)：用20μm的(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼孵育三日龄斑马鱼30分钟，作为d组检测物；

44、e组(实验组1)：将三日龄斑马鱼用50μm的cu2+处理30min后，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液洗涤3次去除多余的cu2+，再用20μm的探针溶液处理30min，作为e组检测物；

45、f组(实验组2)：将三日龄斑马鱼用50μm的cu2+处理30min后，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液洗涤3次去除多余的cu2+，再用20μm的探针溶液处理30min，最后用50μm的草甘膦处理30min，作为f组检测物；

46、通过a，b，c，d，e，f组荧光成像结果显示20μm的(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼能够进入细胞中，并与细胞中的cu2+和草甘膦进行反应，细胞成像能够很明显的看出cu2+和草甘膦在细胞中的分布情况；

47、结果显示在28℃下用(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼处理过的斑马鱼显示出明显的荧光，而同时使用荧光化合物与cu2+处理的斑马鱼产生一定的荧光淬灭现象，随后使用草甘膦处理已经被荧光化合物-cu2+体系孵育的斑马鱼后，产生荧光增强现象；

48、荧光成像结果表明(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼能够进入斑马鱼体内与cu2+产生荧光淬灭现象，然后与草甘膦反应诱导荧光增强，从而达到定向识别cu2+和草甘膦的效果。

49、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

50、1、本发明中发光物质的合成原料容易获得，价格便宜，且由7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼和4-二乙氨基苯甲醛反应制备得到(e)-7-(二乙基氨基)-n'-(4-(二乙基胺)-2-羟基亚苄基)-2-氧代-2h-色烯-3-碳酰肼，收率能够达到68.6％，相较于现有技术而言，其收率得到了大幅度的提升，关键在于其反应条件温和，并且具有很好的稳定性；

51、2、本发明中由4-二乙氨基苯甲醛、丙二酸二乙酯和吡咯烷反应制备得到7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-铬烯-3-羧酸乙酯，其产率能够达到80.9％，相较于现有技术而言，其产率大大得到的提高；

52、3、本发明中荧光化合物中定向识别的设计，显著提高了荧光探针对cu2+和草甘膦的选择性和灵敏度，并且该荧光化合物不与生物体内常见其它分析物反应，且在常见分析物的干扰下可有效的检测cu2+和草甘膦，即该荧光化合物抗干扰能力强，不仅如此，该荧光化合物能在各种活细胞的生长环境下有效检测外源性cu2+和草甘膦，同时该荧光化合物的logp＝4.55,表明该荧光化合物是亲脂性化合物，具有较好的细胞膜通透性，在不同浓度的细胞毒性试验表明该荧光化合物具有较低的细胞毒性，另外该荧光化合物可有效的特异性识别生物体内的cu2+和草甘膦，并成功应用于hela细胞及斑马鱼成像中。