三角褐指藻CHLC基因以及编码的蛋白在叶绿素c合成中的应用

本发明属于生物，具体涉及三角褐指藻chlc基因、蛋白及在叶绿素c合成中的应用。

背景技术：

1、叶绿素广泛存在于光合生物中，具有捕捉光能的特性，属于光合生物捕光复合体中重要的天线分子，在光合作用光能捕捉方面具有重要应用。由于结构的多样性，不同的叶绿素具有不同的吸收光谱。蓝绿光在海水中穿透能力强，因而海洋藻类大多含有叶绿素c，用于捕捉蓝绿波段可见光。叶绿素c如被转移到其他光合生物中，可用于拓宽捕光光谱，提高光合作用效率。

2、目前，叶绿素c的合成通路尚未被解析。更没有关于合成叶绿素c的基因的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种三角褐指藻(phaeodactylum tricornutum)chlc基因及上述基因编码的蛋白在叶绿素c合成中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

3、一种chlc基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的核苷酸序列由1230个碱基组成，或在严格条件下与seq id no.1限定的dna序列杂交的dna分子。

4、上述基因编码的蛋白质(1)，其氨基酸序列如seq id no.2所示。所述的序列由409个氨基酸残基组成。

5、上述chlc基因编码的蛋白还可以包括将seq id no.2氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白；或与(1)限定的蛋白序列有80％(较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高)以上同源性且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白。

6、含有chlc基因的转基因生物，基因编辑载体均属于本发明的保护范围，其中所述转基因生物包括藻类、光合细菌或陆地植物。

7、本发明最重要的一个发明点在于公开了chlc基因的一个新功能，本发明通过基因编辑获得chlc敲除突变体，通过突变体和野生型的三角褐指藻相比，突变体缺失叶绿素c1、c2，而是积累了叶绿素生物合成通路中间过程化合物——二乙烯基原叶绿素内酯(dvpchlide a，dvp)和单乙烯基原叶绿素内酯(mv pchlide a，mvp)。可见，chlc基因或蛋白参与了叶绿素c的合成，也就是说叶绿素c生物合成基因具有提高三角褐指藻中叶绿素c含量的功能，可以用于提高微生物(藻类、真菌、细菌)生产叶绿素c的产量；并且，用于在光合生物(植物、藻类、光合细菌)中能提高光合生物体内叶绿素c含量，继而提高捕光效率，对光合作用效率和生物量积累有利，上述方式可以通过转基因的方式来实现。

8、另外，通过对chlc蛋白的酶学功能的鉴定，结果发现，只有在chlc蛋白存在的前提下，二乙烯基原叶绿素内酯和单乙烯基原叶绿素内酯才会被分别转化为叶绿素c2、c1，因此，chlc基因所编码蛋白还可用于叶绿素c的体外合成。

9、这里需要说明的是，本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述chlc基因，还包括与seq id no.1具有较高同源性(如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因。

10、本发明的优点：

11、在三角褐指藻中我们首次找到一个chlc基因，该基因所编码蛋白负责叶绿素c的生物合成，也就是说本发明首次公开了chlc基因的一个新功能，其能够提高三角褐指藻中叶绿素c含量。并且，用于在光合生物(植物、藻类、光合细菌)中能提高光合生物体内叶绿素c含量，继而提高捕光效率，对光合作用效率和生物量积累有利，并且该基因所编码蛋白能够在生物体外用于叶绿素c合成。

技术特征：

1.三角褐指藻chlc基因或其编码的蛋白或含有所述基因的重组生物在叶绿素c合成中的应用，其特征在于，所述三角褐指藻chlc基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述叶绿素c包括叶绿素c1、c2。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，叶绿素c的合成前体为二乙烯基原叶绿素内酯和单乙烯基原叶绿素内酯。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，chlc敲除突变体完全缺失叶绿素c，并且所述chlc敲除突变体的类胡萝卜素-岩藻黄素含量降低。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组生物为藻类、光合细菌或陆地植物。

6.三角褐指藻chlc基因编码的蛋白在生物体外合成叶绿素c中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

7.一种获得转基因生物的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1中所述的三角褐指藻chlc基因转入目的植物得到转基因生物，所述转基因生物内的叶绿素c含量和/或捕光效率高于目的生物。

8.一种体外合成叶绿素c的方法，其特征在于，所述方法为：将50μl缓冲液加入纯化干燥后的前体一一二乙烯基原叶绿素内酯和单乙烯基原叶绿素内酯，通过超声混匀溶解该前体；继而加入5mm l-抗坏血酸、5mmα-酮戊二酸、0.1mm硫酸亚铁、50μg纯化chlc蛋白，反应两小时后，加入30μl丙酮与60μl乙酸乙酯，混匀以终止反应；在反应终止后通过离心对叶绿素c产物进行萃取：吸取上清有机层，氮气吹干，用50μl甲醇水溶液溶解，即得；所述chlc蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

技术总结
本发明公开了三角褐指藻CHLC基因以及编码的蛋白在叶绿素c合成中的应用，本发明首次公开了CHLC基因的一个新功能，其能够提高三角褐指藻中叶绿素c含量；并且，用于在光合生物(植物、藻类、光合细菌)中能提高光合生物体内叶绿素c含量，继而提高捕光效率，对光合作用效率和生物量积累有利，并且该基因所编码蛋白能够在生物体外用于叶绿素c合成。

技术研发人员：李小波,蒋彦酉,曹天骏
受保护的技术使用者：西湖大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16