一种醇脱氢酶突变体及其应用

本申请涉及酶工程和基因工程领域，具体涉及一种醇脱氢酶突变体及其应用。

背景技术：

1、哌啶酮是一类含n原子的杂环酮类化合物，在制药工业中具有重要的应用有价值。以哌啶酮为中间体可以用于合成降血糖类和抗癌类药物分子。鉴于哌啶酮在药物分子合成中的巨大价值，其合成技术的研发已成为药物开发领域的研究热点。目前具有多种化学合成路线可用于此类化合物合成包括曼尼奇缩合反应、不对称合成反应和氧化还原反应。传统的化学方法存在反应步骤复杂，产率低等问题。利用酶法催化醇类氧化物的氧化策略同样可以获得目标哌啶酮，且酶法催化的氧化反应可以在常温、常压的温和条件下进行。但是由于哌啶醇是一类n-杂环化醇化合物，结构上与环己醇类似，但极性强于环己醇，且溶于水后呈碱性，这种化学特性使得能催化哌啶醇氧化的醇脱氢酶鲜有报道。

2、利用醇脱氢酶为催化剂合成哌啶酮作为一条绿色环保的合成路线，应用前景非常广阔。此外，采用理性设计对生物催化剂进行分子改造，提高天然酶的催化性能、对推动其工业化应用进程具有重要意义。但是目前已知醇脱氢酶催化活力偏低,因此，需要开发更加高效酶催化剂，以降低反应成本。

技术实现思路

1、基于此，本申请有必要提供一种醇脱氢酶突变体，与现有技术相比，该醇脱氢酶突变体在催化哌啶醇的氧化反应中活性得到了显著提升。

2、本申请还提供了该醇脱氢酶突变体的用途，所述醇脱氢酶突变体可用于合成哌啶酮；同时利用上述醇脱氢酶突变体偶联亚胺还原酶可用于合成手性氨基哌啶。

3、具体技术方案如下：

4、一种醇脱氢酶突变体，所述醇脱氢酶突变体与seq id no：1所示的野生型醇脱氢酶相比，第151位亮氨酸位点和第195位异亮氨酸位点中至少一个发生突变。

5、在其中一个实施例中，所述突变选自以下突变方式(1)～(2)中的至少一种：

6、(1)将第151位亮氨酸位点突变为苯丙氨酸、酪氨酸或者组氨酸；和

7、(2)将第195位异亮氨酸位点突变为亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸或者半胱氨酸。

8、一种分离的核酸分子，包含编码所述的醇脱氢酶突变体的核苷酸片段。

9、一种重组表达载体，包含所述的分离的核酸分子。

10、一种重组宿主细胞，包含所述的分离的核酸分子或所述的重组表达载体。

11、一种催化剂，包含所述的醇脱氢酶突变体。

12、所述的醇脱氢酶突变体在催化哌啶醇类化合物发生氧化反应制备哌啶酮中的用途。

13、所述的醇脱氢酶突变体偶联亚胺还原酶在催化哌啶醇类化合物制备手性氨基哌啶的用途。

14、相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：

15、本申请从野生型醇脱氢酶出发，通过酶分子序列比对分析和结构模拟，锁定醇脱氢酶底物结合口袋周围的关键位点，通过定向设计，构建了醇脱氢酶突变体，获得了一系列分子量提升的突变株，相比野生型其催化合成哌啶酮类化合物的活性得到了显著提升。

16、进一步发现，本申请设计的醇脱氢酶突变体不仅可用于合成哌啶酮类化合物，同时可偶联亚胺还原酶通过借氢级联反应制备手性氨基哌啶，可以显著加快级联反应中第一步的氧化反应，提升了整个级联反应的催化效率。

技术特征：

1.一种醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体与seq id no：1所示的野生型醇脱氢酶相比，第151位亮氨酸位点和第195位异亮氨酸位点中至少一个发生突变。

2.根据权利要求1所述的醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变选自以下突变方式(1)～(2)中的至少一种：

3.根据权利要求1所述的醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变选自突变方式(1)～(2)中的两种：

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，包含编码权利要求1～3任一项所述的醇脱氢酶突变体的核苷酸片段。

5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述的分离的核酸分子；

6.一种重组宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的分离的核酸分子或权利要求5所述的重组表达载体；

7.一种催化剂，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的醇脱氢酶突变体；

8.权利要求1～3任一项所述的醇脱氢酶突变体或权利要求7所述的催化剂在催化哌啶醇类化合物发生氧化反应制备哌啶酮中的用途。

9.权利要求1～3任一项所述的醇脱氢酶突变体或权利要求7所述的催化剂偶联亚胺还原酶在催化哌啶醇类化合物制备手性氨基哌啶的用途。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述哌啶醇类化合物包括1-甲基哌啶-4-醇、1-乙基哌啶-4-醇、1-乙基哌啶-3-醇、1-异丙基哌啶-3-醇、1-异丙基哌啶-4-醇、1-叔丁基哌啶-4-醇、1-环丙基哌啶-4-醇、甲基4-羟基哌啶-1-甲酸基酯、1-boc-3-羟基吡咯、n-boc-4-羟基哌啶、n-boc-3-羟基哌啶、1-苯基吡咯-3-醇、1-苯基哌啶-4-醇和1-苯基哌啶-3-醇中的至少一种。

技术总结
本申请涉及一种醇脱氢酶突变体，所述醇脱氢酶突变体包含由SEQ ID NO：1所示的野生型醇脱氢酶的氨基酸片段发生突变得到的氨基酸片段，所述突变的氨基酸位点包括SEQ ID NO：1中的第151位亮氨酸位点和第195位异亮氨酸位点中至少一个发生突变。与野生型醇脱氢酶相比，该醇脱氢酶突变体催化合成哌啶酮类化合物的活性得到了显著提升。此外本申请提供的醇脱氢酶的突变体可偶联亚胺还原酶通过借氢级联反应制备手性氨基哌啶。

技术研发人员：于慧敏,李付龙
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16