一种CmD53基因及其突变体的克隆、表达和应用

本发明涉及一种调控菊花花期的靶基因和方法，具体涉及一种cmd53基因及其突变体的表达载体、构建方法和应用。

背景技术：

1、菊花(chrysanthemum morifolium)花期调控是实现市场周年供应的关键。菊花生产中主要通过光温调节来进行花期调控，存在生产成本高且品质难以保障等不足。

2、cmd53基因来源于菊花‘神马’独脚金内酯信号路径基因，是特异响应独脚金内酯(sl)信号的抑制因子，cmd53蛋白依赖于sl诱导降解。基于前期发现外源sl类似物rac-gr24(gr24)处理使菊花花期提前，而sl合成抑制剂(tis108)处理推迟菊花开花，申请人尝试探索与sl有关的cmd53基因对菊花花期的影响和新的花期调控策略，为菊花花期改良工程育种提供优异基因储备。但目前关于cmd53基因调控菊花开花时间的研究尚未见报道。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种cmd53基因及其突变体，解决获取调控菊花花期全新靶点的问题。本发明的另一目的在于提出cmd53基因及其突变体的克隆方法，解决如何获得cmd53基因及其突变体基因的问题。本发明的第三个目的在于提供cmd53基因及其突变体的植物表达载体，解决如何在菊花细胞中过表达cmd53基因及其突变体的问题；本发明的第四个目的在于提供一种推迟菊花花期的方法，解决如何靶向cmd53蛋白调控菊花花期的问题。

2、技术方案：本发明所述的一种cmd53基因，其cdna序列如seq id no：1所示。本发明所述的一种cmd53基因突变体cmd53m，其cdna序列如seq id no：2所示。

3、第二方面，本发明提供一种上述cmd53基因的克隆方法，具体包括以菊花的cdna为模板，采用cmd53基因克隆引物进行pcr反应，获得cmd53基因片段；所述cmd53基因克隆引物为：

4、cmd53-f：atgccgacgccggtaagcacagc；

5、cmd53-r：tcaaccaactatgattcttgaagg。

6、在一些实施例中，以菊花‘神马’材料的cdna为模板，根据cmd53基因序列信息设计开放阅读框特异性引物cmd53-f和cmd53-r，进行pcr反应，产物与pmd19-t载体进行连接，得到包含cmd53基因序列的pmd19-t-cmd53质粒。pmd19-t-cmd53质粒转化dh5α感受态细胞，克隆获得序列为seq id no：1的菊花cmd53基因。

7、本发明还提供一种cmd53基因突变体cmd53m的克隆方法，具体为以包含cmd53基因序列的重组载体为模板，利用重叠延伸pcr进行基因定点突变获得cmd53基因突变体片段。

8、优选地，所述重叠延伸pcr的方法为：

9、(1)以包含cmd53基因序列的pmd19-t-cmd53质粒为模板，采用引物对一和引物对二分别进行pcr反应，得到目的片段a和目的片段b；

10、所述引物对一为：

11、cmd53-r4-f：tttctagaaggccttggatccaatgccgacgccggtaagcacagc；

12、cmd53m-soe-r：aatataattcgtgataaatgatggatcagaaaggttc；

13、所述引物对二为：

14、cmd53m-soe-f：tctgatccatcatttatcacgaattatattgctgagg；

15、cmd53-r4-r：ggccgcaaagtcgacgaattctaccaactatgattcttgaagg；

16、(2)以目的片段a和目的片段b为共同模板，采用引物对三进行pcr反应，得到包含载体同源序列的cmd53基因突变体片段，即cmd53m片段；

17、所述引物对三为：

18、cmd53-r4-f：tttctagaaggccttggatccaatgccgacgccggtaagcacagc；

19、cmd53-r4-r：ggccgcaaagtcgacgaattctaccaactatgattcttgaagg。

20、第三方面，本发明提供一种含有上述cmd53基因的植物表达载体pore-r4-cmd53以及一种含有上述cmd53基因突变体cmd53m的植物表达载体pore-r4-cmd53m。将上述克隆扩增产物cmd53基因片段或突变体cmd53m片段分别与由bamh i和ecor i双酶切的pore-r4载体质粒同源重组，构建植物表达载体pore-r4-cmd53或pore-r4-cmd53m。

21、第四方面，本发明提供一种推迟菊花花期的方法，包括在菊花细胞内提高cmd53蛋白或cmd53同工蛋白cmd53m的含量；所述cmd53同工蛋白cmd53m抗菊花独脚金内酯降解且与cmd53蛋白的生物功能相同。

22、优选地，所述在菊花细胞内提高cmd53蛋白含量的方法为：将上述含有cmd53基因的植物表达载体转染菊花细胞，在菊花细胞中过表达cmd53蛋白。

23、优选地，所述在菊花细胞内提高cmd53同工蛋白cmd53m含量的方法为：将上述含有cmd53基因突变体cmd53m的植物表达载体转染菊花细胞，在菊花细胞中过表达cmd53突变体cmd53m蛋白，所述cmd53突变体cmd53m蛋白较cmd53蛋白缺失第699～702位rgkt氨基酸序列。

24、在一些实施例中，转染方法优选为农杆菌介导法，具体包括以植物表达载体pore-r4-cmd53和pore-r4-cmd53m分别转化eha105农杆菌感受态细胞，通过农杆菌介导的叶盘侵染法转化菊花‘神马’，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化植株。为了鉴定阳性转化植株，申请人还针对cmd53和cmd53m进行了pcr检测验证、qrt-pcr检测验证及western blot检测验证，结果表明cmd53和cmd53m均成功地在菊花细胞内过表达。

25、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明将sl信号路径抑制子cmd53及抗sl降解的cmd53m基因片段导入菊花植株，cmd53及cmd53m过表达转基因植株开花时间明显晚于野生型对照组植株，获得了开花明显推迟的转基因菊花，克服生产上通过补光来延迟菊花开花，降低生产成本，提高菊花的观赏品质。

技术特征：

1.一种cmd53基因，其特征在于，其cdna序列如seq id no：1所示。

2.一种如权利要求1所述cmd53基因的克隆方法，其特征在于：包括以菊花的cdna为模板，采用cmd53基因克隆引物进行pcr反应，获得cmd53基因片段；所述cmd53基因克隆引物为：

3.一种含有权利要求1所述cmd53基因的植物表达载体。

4.一种cmd53基因突变体，其特征在于，其cdna序列如seq id no：2所示。

5.一种如权利要求4所述cmd53基因突变体的克隆方法，其特征在于：包括以包含cmd53基因序列的重组载体为模板，利用重叠延伸pcr进行基因定点突变获得cmd53基因突变体片段。

6.根据权利要求5所述cmd53基因突变体的克隆方法，其特征在于，所述重叠延伸pcr的方法为：

7.一种含有权利要求4所述cmd53基因突变体的植物表达载体。

8.一种推迟菊花花期的方法，其特征在于，包括在菊花细胞内提高cmd53蛋白和/或cmd53同工蛋白的表达水平；所述cmd53同工蛋白抗菊花独脚金内酯降解且与cmd53蛋白的生物功能相同。

9.根据权利要求8所述推迟菊花花期的方法，其特征在于，所述在菊花细胞内提高cmd53蛋白表达水平的方法为：将权利要求3所述表达载体转染菊花细胞，在菊花细胞中过表达cmd53蛋白。

10.根据权利要求8所述推迟菊花花期的方法，其特征在于，所述在菊花细胞内提高cmd53同工蛋白表达水平的方法为：将权利要求7所述表达载体转染菊花细胞，在菊花细胞中过表达cmd53突变体蛋白，所述cmd53突变体蛋白较cmd53蛋白缺失第699-702位rgkt氨基酸序列。

技术总结
本发明公开了一种CmD53基因及其突变体的克隆、表达和应用，本发明中CmD53基因的cDNA序列如SEQ ID No：1所示；CmD53基因突变体(CmD53m)的cDNA序列如SEQ ID No：2所示。克隆CmD53基因及其突变体后重组构建了pORE‑R4‑Cm D53和pORE‑R4‑CmD53m植物表达载体，利用表达载体在菊花细胞内过表达CmD53蛋白或抗降解的CmD53同工蛋白，进而调控菊花花期。本发明克隆菊花CmD53基因并构建CmD53和CmD53m的植物表达载体，采用农杆菌介导法将其导入植株，探索其对菊花花期的影响和新的策略，为菊花花期改良工程育种提供优异基因储备。

技术研发人员：陈素梅,张一,李菲,邢莹莹,王新慧,蒋甲福,王利凯,陈发棣,廖园,何玉华
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15