可多聚化的CAR分子及其构建方法和其应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及可多聚化的car分子及其构建方法和其在增效car t细胞抗瘤效能中的应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤为全球发病率和死亡率最高的疾病之一。流行病学数据显示，我国恶性肿瘤发病率占全球23％、死亡率占30％。我国肿瘤防治形势严峻，开发新的肿瘤治疗手段势在必行。近年来，以嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)疗法为代表的免疫治疗取得了巨大成功，并成为肿瘤精准治疗领域的研究热点。但cart细胞的自身不足极大地限制了cart治疗的长期获益，包括cart细胞对抗原低表达的肿瘤细胞识别和杀伤能力不足、cart细胞发生耗竭而难以在体内长期维持等。有关cart细胞的改进研究主要聚焦在胞内信号域，对car分子膜外结构的优化还缺乏系统性研究。因此，开发更优异的cart细胞药物具有迫切的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可多聚化的car分子，所述可多聚化的car分子由单链抗体scfv、fkbp结构域(fk506结合蛋白，简称fkbp)、cd8α铰链区和跨膜区、4-1bb共刺激结构区域、cd3胞内信号区域组成。

2、本发明优选技术方案中，在car分子的胞外结构域中设置fkbp结构域。

3、本发明的优选技术方案中，所述fkbp结构域的氨基酸序列如seq id no:1所示，或包含与seq id no：1所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的氨基酸序列。

4、本发明的优选技术方案中，所述fkbp结构域的核苷酸序列如seq id no:2所示，或包含与seq id no：2所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的核苷酸序列。

5、本发明的优选技术方案中，所述fkbp的蛋白数量为1个或多个，优选为1-5个，更优选为2-4个。

6、本发明的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子胞外段设置有1-5个fkbp的蛋白，优选为2-3个。

7、本发明的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子胞外段有两个串联的fkbp的蛋白。

8、本发明的优选技术方案中，所述fkbp的蛋白之间由连接肽连接，所述连接肽包括但不限于二硫键、柔性连接肽。

9、本发明的优选技术方案中，所述柔性连接肽为(ggggs)n，n＝2-5个。

10、本发明的优选技术方案中，所述柔性连接肽的氨基酸序列如seq id no:3所示，核苷酸序列如seq id no:4所示。

11、本发明的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子通过诱导剂诱导后，car分子的fkbp的蛋白发生聚合，形成二聚体或多聚体。

12、本发明的优选技术方案中，所述诱导剂为ap1903。

13、本发明的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子靶向的抗原可选自cd16、cd64、cd78、cd96、cll1、cd116、cd117、cd71、cd45、cd71、cd123、cd138、erbb2(her2/neu)、癌胚抗原(cea)、上皮细胞粘附分子(epcam)、表皮生长因子受体(egfr)、egfr变体iii(egfrviii)、cd19、cd20、cd30、cd40、cd43、双唾液酸神经节苷脂gd2、导管上皮粘蛋白、gp36、tag-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(afp)、外源凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-caix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、muthsp70-2、mcsf、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、laga-1a、p53、prostein、psma、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白b2、cd22、胰岛素生长因子(igf1)-i、igf-ii、igfi受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(mhc)分子、5t4、ror1、nkp30、nkg2d、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域a(eda)和额外结构域b(edb)、腱生蛋白-c的a1结构域(tnca1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、cd3、cd4、cd8、cd24、cd25、cd33、cd34、cd133、cd138、foxp3、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、gm-csf、细胞因子受体、内皮因子、bcma(cd269、tnfrsf17)、tnfrsf17(uniprotq02223)、slamf7(uniprotq9nq25)、gprc5d(uniprotq9nzd1)、fkbp11(uniprotq9nyl4)、kamp3、itga8(uniprotp53708)、fcrl5(uniprotq68sn8)和her2的任一种或其组合。

14、在其中一些实施方式，所述可多聚化的car分子靶向的抗原为cd19和cd20，其中cd19的scfv序列可参考专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1，非专利文献(sabrina k,qi z,michael s,fran,ois-loic c,els v,buchholz cj.cd19 andcd20 targeted vectors induce minimal activation of resting b lymphocytes.plosone 2013,8(11):e79047；或ruella m,barrett dm,kenderian ss,shestova o,hofmanntj,perazzelli j,et al.dual cd19 and cd123 targeting prevents antigen-lossrelapses after cd19-directed immunotherapies.j clin invest 2016,126(10):3814-3826.或turtle cj,hanafi la,berger c,gooley ta,cherian s,hudecek m,etal.cd19car-t cells of defined cd4+:cd8+composition in adult b cell allpatients.j clin invest 2016,126(6):2123-2138.或gust j,hay ka,hanafi la,li d,myerson d,gonzalez-cuyar lf,et al.endothelial activation and blood-brainbarrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with cd19car-t cells.cancer discov 2017,7(12):1404-1419.)，在一些实施方式中，所述anti-cd19 scfv序列的氨基酸序列如seq id no:5所示，核苷酸序列如seq id no:6所示。

15、cd20的scfv序列可参考专利文献cn107245107b、cn109306013b、wo2018218876a1，非专利文献(sabrina k,qi z,michael s,fran ois-loic c,els v,buchholz cj.cd19and cd20 targeted vectors induce minimal activation of resting blymphocytes.plos one 2013,8(11):e79047.)，在一些实施方式中，所述anti-cd20 scfv序列的氨基酸序列如seq id no:7所示，核苷酸序列如seq id no:8所示。

16、cd8α铰链区和跨膜区可参见专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1,在一些实施方式中，所述cd8α铰链区的氨基酸序列如seq id no:9所示，核苷酸序列如seq id no:10所示。所述cd8α跨膜区的氨基酸序列如seq id no:11所示，核苷酸序列如seq id no:12所示。

17、4-1bb共刺激结构区域可参见专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1,在一些实施方式中，4-1bb的共刺激结构域的氨基酸序列如seq id no:13所示，核苷酸序列如seq id no:14所示。

18、cd3胞内信号区域可参见专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1,在一些实施方式中，cd3ζ胞内信号结构域的氨基酸序列如seq id no:15所示，核苷酸序列如seq id no:16所示。

19、本发明的目的在于提供一种可多聚化的car t细胞的构建方法，即在car分子的胞外结构域中设置fkbp结构域。

20、本发明优选技术方案中，所述可多聚化的car分子由scfv、fkbp结构域、cd8α铰链区和跨膜区、4-1bb共刺激结构区域、cd3胞内信号区域组成。

21、本发明的优选技术方案中，所述fkbp结构域的氨基酸序列如seq id no:1所示，或包含与seq id no：1所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的氨基酸序列。

22、本发明的优选技术方案中，所述fkbp结构域的核苷酸序列如seq id no:2所示，或包含与seq id no：2所示的序列具有至少85％以上、或至少88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％以上、同源性的核苷酸序列。

23、本发明的优选技术方案中，所述fkbp的蛋白数量为1个或多个，优选为1-5个，更优选为2-4个。

24、本发明的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子胞外段设置有1-5个fkbp的蛋白，优选为2-3个。

25、本发明的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子胞外段有两个串联的fkbp的蛋白。

26、本发明的优选技术方案中，所述fkbp的蛋白之间由连接肽链接，所述连接肽包括但不限于二硫键、柔性连接肽。

27、本发明的优选技术方案中，所述柔性连接肽为(ggggs)n，n＝2-5个。

28、本发明的优选技术方案中，所述柔性连接肽的氨基酸序列如seq id no:3所示，核苷酸序列如seq id no:4所示。

29、本发明的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子通过诱导剂诱导后，car分子的fkbp的蛋白发生聚合，形成二聚体或多聚体。

30、本发明的优选技术方案中，所述诱导剂为ap1903。

31、本发明的优选技术方案中，所述可多聚化的car分子靶向的抗原可选自cd16、cd64、cd78、cd96、cll1、cd116、cd117、cd71、cd45、cd71、cd123、cd138、erbb2(her2/neu)、癌胚抗原(cea)、上皮细胞粘附分子(epcam)、表皮生长因子受体(egfr)、egfr变体iii(egfrviii)、cd19、cd20、cd30、cd40、cd43、双唾液酸神经节苷脂gd2、导管上皮粘蛋白、gp36、tag-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(afp)、外源凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-caix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、mcsf、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、laga-1a、p53、prostein、psma、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白b2、cd22、胰岛素生长因子(igf1)-i、igf-ii、igfi受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(mhc)分子、5t4、ror1、nkp30、nkg2d、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域a(eda)和额外结构域b(edb)、腱生蛋白-c的a1结构域(tnc a1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、cd3、cd4、cd8、cd24、cd25、cd33、cd34、cd133、cd138、foxp3、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、gm-csf、细胞因子受体、内皮因子、bcma(cd269、tnfrsf17)、tnfrsf17(uniprot q02223)、slamf7(uniprot q9nq25)、gprc5d(uniprotq9nzd1)、fkbp11(uniprot q9nyl4)、kamp3、itga8(uniprot p53708)、fcrl5(uniprotq68sn8)和her2的任一种或其组合。

32、在其中一些实施方式，所述可多聚化的car分子靶向的抗原为cd19和cd20，其中cd19的scfv序列可参考专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1，非专利文献(sabrina k,qi z,michael s,fran,ois-loic c,els v,buchholz cj.cd19 andcd20 targeted vectors induce minimal activation of resting b lymphocytes.plosone 2013,8(11):e79047.或ruella m,barrett dm,kenderian ss,shestova o,hofmanntj,perazzelli j,et al.dual cd19 and cd123 targeting prevents antigen-lossrelapses after cd19-directed immunotherapies.j clin invest 2016,126(10):3814-3826.或turtle cj,hanafi la,berger c,gooley ta,cherian s,hudecek m,etal.cd19car-t cells of defined cd4+:cd8+composition in adult b cell allpatients.j clin invest 2016,126(6):2123-2138.或gust j,hay ka,hanafi la,li d,myerson d,gonzalez-cuyar lf,et al.endothelial activation and blood-brainbarrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with cd19car-t cells.cancer discov 2017,7(12):1404-1419.)，在一些实施方式中，所述anti-cd19 scfv序列的氨基酸序列如seq id no:5所示，核苷酸序列如seq id no:6所示。

33、cd20的scfv序列可参考专利文献cn107245107b、cn109306013b、wo2018218876a1，非专利文献(sabrina k,qi z,michael s,fran ois-loic c,els v,buchholz cj.cd19and cd20 targeted vectors induce minimal activation of resting blymphocytes.plos one 2013,8(11):e79047.)，在一些实施方式中，所述anti-cd20 scfv序列的氨基酸序列如seq id no:7所示，核苷酸序列如seq id no:8所示。

34、cd8α铰链区和跨膜区可参见专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1,在一些实施方式中，所述cd8α铰链区的氨基酸序列如seq id no:9所示，核苷酸序列如seq id no:10所示。所述cd8α跨膜区的氨基酸序列如seq id no:11所示，核苷酸序列如seq id no:12所示。

35、4-1bb共刺激结构区域可参见专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1,在一些实施方式中，4-1bb的共刺激结构域的氨基酸序列如seq id no:13所示，核苷酸序列如seq id no:14所示。

36、cd3胞内信号区域可参见专利文献wo2020042648a1、wo2019206326a1、wo2021162521a1,在一些实施方式中，cd3ζ胞内信号结构域的氨基酸序列如seq id no:15所示，核苷酸序列如seq id no:16所示。

37、本发明的另一目的在于提供一种t细胞，其表达可多聚化的car分子。

38、本发明的另一目的在于提供一种试剂盒，包括可多聚化的car分子和诱导剂。

39、本发明的目的在于提供一种可多聚化的car分子在杀伤肿瘤细胞中的应用。

40、本发明的优选技术方案中，所述应用为，将可多聚化的car分子、肿瘤细胞、诱导剂混合，所述可多聚化的car分子在诱导剂诱导后，car分子的fkbp的蛋白发生聚合，形成二聚体或多聚体，对肿瘤细胞进行杀伤。

41、本发明的目的在于提供一种可多聚化的car分子用于制备抗肿瘤药物中的应用。

42、本发明优选的技术方案中，所述肿瘤选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、脑肿瘤、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤、骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症的任一种或其组合。

43、除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

44、与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

45、1、本发明通过诱导car分子多聚化，可提高对免疫受体酪氨酸激活基序(i tams)的磷酸化、形成稳定有序免疫突触，更快诱发激活信号、脱颗粒效应，实现更好的抗肿瘤作用且安全有效。

46、2、本发明通过诱导car分子多聚化，显著提高了car t细胞激活效率，促进形成稳定有序的免疫突触，增强了car t细胞对低抗原密度肿瘤细胞的识别能力，显著提高了cart细胞的抗肿瘤功能，且显著阻遏肿瘤抗原刺激引发的t细胞耗竭，显著提高了抗肿瘤疗效和治疗的靶向性及精准性，为肿瘤患者提供了更多的治疗选择。

47、3、本发明通过诱导car分子多聚化，显著降低了炎性因子的分泌。炎性因子的降低利于降低car t治疗的毒副作用，减轻了患者的治疗痛苦并提高生活质量，使car t细胞的杀瘤模式变得更加经济，减少患者的治疗费用并降低其治疗负担，保障了肿瘤患者的用药有效性和安全性，造福肿瘤患者。

48、4、本发明的方法具有操作简便、稳定可靠、成本更优、适宜工业化生产等优点。