一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法与流程

本发明涉及蛋白提取领域，尤其是涉及一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法。

背景技术：

1、超氧化物歧化酶，别名肝蛋白、简称:sod。sod是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质超氧阴离子自由基。

2、sod是生物体内氧自由基的天然清除剂，具有广泛的医用价值，具有抗炎症、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老和缺血后再灌流损伤的恢复等功能，因而可以治疗由超氧自由基引起的多种疾病，尤其是对关节炎和类风湿性关节炎有特殊的疗效，可作为药品、食品及日化产品的添加剂和溶血液制备。

3、目前sod纯化制备方法各异，常用方法有经典法、离子交换法、疏水色谱法、凝胶过滤法和金属螯合亲和层析法等，大都采用柱层析法分离纯化，需要消耗大量缓冲盐和长时间洗柱过柱层析，成本较高、效率较低，因此，还有改善空间。

技术实现思路

1、为了降低成本、提高效率，本申请提供一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法。

2、本申请提供的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法采用如下的技术方案：一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：

3、步骤1)，从新鲜牛血中分离得红细胞，将红细胞溶胀破壁，得溶血液；

4、步骤2)，向溶血液中加入水溶性含铜化合物，搅拌加热至50-70℃，保温20-30min，降温至5-10℃，加入助沉剂，离心，取上清液；

5、步骤3)，超滤浓缩，得浓缩液；

6、步骤4)，将浓缩液冷却至2-4℃，调节ph为4.8-5，加入2-4℃的无水乙醇，静置1-2h，离心，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用2-4℃ph为4.8-5的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物；

7、步骤5)，将二次沉淀物用水溶解，然后超滤、干燥，得牛血cu-zn超氧化物歧化酶；

8、所述助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配。

9、通过采用上述技术方案，在铜离子存在的条件下，通过加热，使得大多数杂蛋白尤其是血红蛋白在50-70℃高温下变性，但目标产物sod能在70℃仍旧保持稳定，不会出现变性，然后通过特殊的助沉剂将变性的血红蛋白快速沉淀下来，在离心的配合下，能快速得到上清液，通过将上清液浓缩后，能得到sod浓度较高的浓缩液，然后再配合在2-4℃及4.8-5的ph条件下加入无水乙醇，能使得浓缩液中的sod析出，通过离心得到沉淀物，此时即可得到纯度较高的sod，再配合超滤，进一步出去母液杂蛋白，即可获得高纯度的目标产品sod，而且获得的sod具有较高的活性，提取工艺成本较低，效率较高，制得的产品质量较佳。

10、通过助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，能使得变性蛋白更容易被助沉剂吸附，从而通过离心即可快速分离沉淀和上清液，若没有特殊的助沉剂辅助，离心时沉淀与上清液难以分离，导致分离效率大幅下降。

11、优选的，所述助沉剂中聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8-9：3-4：2-3。

12、通过采用上述技术方案，通过具体选择聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例，使得变性蛋白能更好地被助沉剂吸附，从而更易于分离得到沉淀和上清液，提取sod的效率更高。

13、优选的，所述步骤2)中，每1l溶血液中加入1-5g助沉剂。

14、通过采用上述技术方案，通过具体选择助沉剂的投入量，起到很好的吸附变性蛋白以提高分离效率的效果，同时更好地控制成本，sod提取成本较低，具有较高的经济价值。

15、优选的，所述步骤1)中，从新鲜牛血中分离得红细胞时，通过向新鲜牛血中加入柠檬酸钠溶液，然后经离心分离得红细胞。

16、通过采用上述技术方案，通过添加柠檬酸钠能起到较好的抗凝效果，减少牛血凝固导致原材料浪费的现象，具有更高的经济价值。

17、优选的，所述步骤1)中，将红细胞溶胀破壁时，先用生理盐水洗涤，然后加入去离子水溶胀破壁。

18、通过采用上述技术方案，通过采用生理盐水洗涤，减少红细胞上带有的杂质，使得制得的溶血液的杂质更少，更有利于提高sod的纯度。

19、优选的，所述步骤2)中，水溶性含铜化合物为氯化铜。

20、通过采用上述技术方案，通过具体选择氯化铜，保持sod的活性的效果更佳，制得的sod的活性更高，质量更好。

21、优选的，所述步骤2)中，每500ml溶血液中投入0.9-1.1g氯化铜。

22、通过采用上述技术方案，通过具体选择氯化铜的投入量，保持sod的活性的效果更佳，制得的sod的活性更高，质量更好，同时能较好地控制成本，具有更高的经济价值。

23、优选的，所述步骤4)中，将浓缩液冷却至4℃，调节ph为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，离心，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃ph为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。

24、通过采用上述技术方案，通过具体选择4℃和ph为4.95的条件，使得sod析出效果更佳，得到的sod更多，收率更高，具有更高的经济价值。

25、优选的，所述步骤3)中，超滤浓缩时，先用0.45um滤膜过滤后，再用3k超滤膜浓缩。

26、通过采用上述技术方案，通过先过滤，能进一步减少杂蛋白，有助于提高sod的纯度，制得的sod质量较高。

27、优选的，所述步骤3)中，浓缩液体积与步骤1)中处理的新鲜牛血的体积比例≤1/10。

28、通过采用上述技术方案，通过具体选择浓缩液的体积，得到的浓缩液中sod的浓度恰到好处，避免浓度过低导致加入乙醇后sod难以析出的情况，使得sod的收率较高。

29、综上所述，本申请具有以下有益效果：

30、1、由于本申请在铜离子存在的条件下，通过加热，使得大多数杂蛋白尤其是血红蛋白在50-70℃高温下变性，但目标产物sod能在70℃仍旧保持稳定，不会出现变性，然后通过特殊的助沉剂将变性的血红蛋白快速沉淀下来，在离心的配合下，能快速得到上清液，通过将上清液浓缩后，能得到sod浓度较高的浓缩液，然后再配合在2-4℃及4.8-5的ph条件下加入无水乙醇，能使得浓缩液中的sod析出，通过离心得到沉淀物，此时即可得到纯度较高的sod，再配合超滤，进一步出去母液杂蛋白，即可获得高纯度的目标产品sod，而且获得的sod具有较高的活性，提取工艺成本较低，效率较高，制得的产品质量较佳。

31、2、本申请中优选通过助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，能使得变性蛋白更容易被助沉剂吸附，从而通过离心即可快速分离沉淀和上清液。

32、3、本申请中优选通过具体选择聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例，使得变性蛋白能更好地被助沉剂吸附，从而更易于分离得到沉淀和上清液，提取sod的效率更高。

技术特征：

1.一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述助沉剂中聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8-9：3-4：2-3。

3.根据权利要求1所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤2）中，每1l溶血液中加入1-5g助沉剂。

4.根据权利要求1所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤1）中，从新鲜牛血中分离得红细胞时，通过向新鲜牛血中加入柠檬酸钠溶液，然后经离心分离得红细胞。

5.根据权利要求4所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤1）中，将红细胞溶胀破壁时，先用生理盐水洗涤，然后加入去离子水溶胀破壁。

6.根据权利要求1所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤2）中，水溶性含铜化合物为氯化铜。

7.根据权利要求6所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤2）中，每500ml溶血液中投入0.9-1.1g氯化铜。

8.根据权利要求1所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤4）中，将浓缩液冷却至4℃，调节ph为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，离心，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃ph为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。

9.根据权利要求1所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤3）中，超滤浓缩时，先用0.45um滤膜过滤后，再用3k超滤膜浓缩。

10.根据权利要求9所述的一种牛血cu-zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤3）中，浓缩液体积与步骤1）中处理的新鲜牛血的体积比例≤1/10。

技术总结
本发明涉及蛋白提取技术领域，具体公开了一种牛血Cu‑Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括：1），从新鲜牛血中分离得红细胞，将红细胞溶胀破壁；2），加入水溶性含铜化合物，搅拌加热至50‑70℃，保温20‑30min，降温至5‑10℃，加入助沉剂，离心，取上清液；3），超滤浓缩；4），冷却至2‑4℃，调节pH为4.8‑5，加入2‑4℃的无水乙醇，静置1‑2h，离心，取沉淀，用2‑4℃pH为4.8‑5的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀；5），用水溶解，然后超滤、干燥，得牛血Cu‑Zn超氧化物歧化酶。本发明具有降低成本、提高效率的优点。

技术研发人员：李长路,刘爱香
受保护的技术使用者：广州蕊特生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16