一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法与流程

本发明属于生物发酵工程，具体涉及了一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法。

背景技术：

1、多杀菌素(spinosad)是刺糖多孢菌(saccharopolyspora spinosa)产生的一种大环内酯类无公害高效生物杀虫剂，兼具化学农药的高效性和生物农药的低毒性，选择性高，无残留，不易产生抗药性，具有良好的环境相容性，可克服化学农药污染环境、破坏生态平衡、易产生耐药性的缺陷，符合国内对生物农药的技术需求，并且对改善环境污染，保障粮食、食品安全有着重要的现实意义。

2、现有技术中制备多杀菌素的方法主要有：

3、cn103667404a公开了一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，通过控制多孢菌菌体生长和多杀菌素合成两个阶段的不同溶氧需求，提高多杀菌素产量，使得多杀菌素产量在发酵196小时达到160.9mg/l。

4、cn107523598a公开了一种提高多杀菌素产量的发酵方法，通过向发酵液中补充复合有机氮源，提高多杀菌素的产量，使得多杀霉素产量在发酵216小时达到5.66g/l。

5、王美玲等在《混合油脂补料发酵提高多杀菌素的产量》的研究中通过在96h补加3％的混合油脂，同时在96h和144h分别补加1％的玉米浆可使多杀菌素发酵单位达到804.59mg/l。

6、多杀菌素是刺糖多胞菌发酵的次级代谢产物，代谢网络具有复杂的非线性调控机制，单纯以时间限制确定补料时间无法适应易被外界条件影响的发酵过程，可能会导致补料达不到应有的效果。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的不足之处，提供了一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其主要包括控制发酵初期糖浓度4％-5％，通过流加葡萄糖使发酵90-200h控还原糖浓度2.5-3.5％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2％，并在菌体量不再变化时补加混合油脂，使多杀菌素的产率提高了50％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供数据支持。

2、本申请的主要发明点在于通过改善发酵工艺，根据实验过程中测得数据适时调整发酵补料，建立一种分段控糖补油手段提高多杀菌素产量的方法，为多杀菌素的工业化生产提供参考。主要包括通过实验确定初始培养基糖添加量，通过还原糖量确定不同时期的补糖量，通过菌体浓度确定补加油脂时间起点等，最大限度地提高多杀菌素的产率。

3、本申请的具体技术方案如下：

4、一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，具体步骤如下：

5、菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，28-30℃培养7-10天后接入摇瓶。

6、摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按1-3％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，27-32℃，180-250rpm，培养3-7天。

7、上述两步均为刺糖多孢菌的常规发酵方案，发明人不再赘述。

8、发酵培养：按10％-20％(v/v)的接种量将刺糖多孢菌种子液接种至装有发酵基础培养基的发酵罐，温度28-32℃，摇瓶转速180-250rpm，发酵罐上根据溶氧水平调节转速和通气量，调整溶氧控制在30％以上，ph控制在6.5-7.2，发酵360-450h；

9、其中从第96h开始每6h取样测菌体量，当菌体量不再变化时停止取样，开始匀速流加混合油脂直至发酵结束；上述混合油脂为油酸甲酯与大豆油，比例为1:1-1:3(v/v)，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.1％-1％。

10、同时从第64h开始每6h取样测还原糖含量，通过流加葡萄糖使发酵90-200h中控制还原糖浓度2.5-3.5％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2％，当多杀菌素含量变化缓慢时停止补糖，继续耗糖至发酵液中还原糖浓度低于0.5％后停止发酵；此时发酵总时长360-450h。

11、其中所用的培养基组成如下：

12、固体培养基：葡萄糖0.3-0.8％，酪蛋白胨0.2-0.7％，酵母浸粉0.3-0.8％，硫酸镁0.2-0.8％，琼脂2％，灭菌前调至ph 6.8-7.3。

13、种子培养基：葡萄糖0.4-1.8％，酵母浸粉0.5-2％，蛋白胨0.5-3％，黄豆饼粉0.5-1.5％，饴糖0.4-0.9％，磷酸二氢钾0.2-0.8％，硫酸镁0.05-0.1％，灭菌前调至ph 6.8-7.3。

14、发酵培养基：葡萄糖4-5％，蛋白粉0.5-1.5％，玉米浆0.4-1.6％，蛋白胨1-1.8％，棉籽蛋白2-6％，油酸甲酯1.5-9％，大豆油1-2％，酵母粉0.6-1.2％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，硫酸铵0.1-0.35％，消泡剂0.5-1％，碳酸钙0.1-1％，灭菌前ph调至7.3-7.5。

15、与现有技术相比，本申请将发酵培养基中葡萄糖的初始浓度降低，现有技术中的初始浓度一般为葡萄糖5-8％，发明人研究后发现，这会导致葡萄糖效应，又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用，即当微生物可以大量利用易降解的底物如葡萄糖时，对于其他较难降解底物的利用能力明显下降，即葡萄糖抑制和排斥了微生物对其他底物的利用。通常微生物会在混合碳源下，选择性的利用最容易降解的底物，而抑制了对难降解底物的利用；本申请将葡萄糖用量降至4-5％的范围后，有效的抑制了葡萄糖效应，提高了对底物的利用率。

16、本发明的技术方案所采用的发酵菌株为刺糖多孢菌(saccharopolysporaspinosa)，优选采用保藏编号为cgmcc no.25093的菌株。该菌株已经在申请人的在先申请申请号202210995561.4，名称为一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法中公开，发明人不再赘述。

17、与现有技术相比，本发明所提供的方法发酵生产多杀菌素，可清晰的判断混合油脂与葡萄糖的补料时间，形成稳定的多杀菌素生产工艺，促进多杀菌素的生产，通过实验验证，相比普通发酵过程，本发明技术方案中多杀菌素的产率提高了50％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供了依据。

技术特征：

1.一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，包括如下步骤：菌种活化、摇瓶培养和发酵培养，其特征在于：

2.根据权利要求1所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：混合油脂为油酸甲酯与大豆油，比例为1:1-1:3v/v，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.1％-1％。

3.根据权利要求1所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：具体步骤如下：

4.根据权利要求1或3所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：菌种活化时固体培养基组成按重量百分比为：葡萄糖0.3-0.8％，酪蛋白胨0.2-0.7％，酵母浸粉0.3-0.8％，硫酸镁0.2-0.8％，琼脂2％，灭菌前调至ph 6.8-7.3。

5.根据权利要求1或3所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：摇瓶培养时种子培养基组成按重量百分比为：葡萄糖0.4-1.8％，酵母浸粉0.5-2％，蛋白胨0.5-3％，黄豆饼粉0.5-1.5％，饴糖0.4-0.9％，磷酸二氢钾0.2-0.8％，硫酸镁0.05-0.1％，灭菌前ph调至6.8-7.3。

6.根据权利要求1或3所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：发酵培养时发酵培养基组成按重量百分比为：葡萄糖4-5％，蛋白粉0.5-1.5％，玉米浆0.4-1.6％，蛋白胨1-1.8％，棉籽蛋白2-6％，油酸甲酯1.5-9％，大豆油1-2％，酵母粉0.6-1.2％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，硫酸铵0.1-0.35％，消泡剂0.5-1％，碳酸钙0.1-1％，灭菌前ph调至7.3-7.5。

技术总结
本发明属于生物发酵工程技术领域，提供了一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其主要包括控制发酵初期糖浓度4％‑5％，通过流加葡萄糖使发酵90‑200h控还原糖浓度2.5‑3.5％，发酵至200‑300h控制发酵液中还原糖浓度为2％，并在菌体量不再变化时补加混合油脂，使多杀菌素的产率提高了50％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供数据支持。

技术研发人员：和富明,田杰伟,杨传伦,陈鑫,翟娇,高保军,陈振发,韩立霞,闫燕,部丽群,傅英旬,郭南南,张萧萧,潘冬梅,杨丹丹,王秀芝
受保护的技术使用者：黄河三角洲京博化工研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15