NK细胞的细胞外囊泡的制备及应用的制作方法

本发明涉及生物医药，尤其涉及nk细胞的细胞外囊泡的制备及应用。

背景技术：

1、自然杀伤细胞（natural killer cells，简称 nk 细胞）是先天淋巴样细胞的一个亚群，是对抗肿瘤的第一道防线。nk细胞具有直接和间接靶向抑制肿瘤细胞的能力，而肿瘤源性分子、肿瘤基质细胞和肿瘤细胞可以抑制这种过程，最终促进肿瘤的进展和多步转移过程。基于nk细胞在肿瘤生物学中的关键作用，很多科研人员把它作为治疗肿瘤疾病的一个前瞻性靶点。同时，nk细胞分泌的细胞外囊泡（ev）具有肿瘤归巢能力，且其含有部分nk细胞的活性物质，可以发挥抗肿瘤的功能。

2、ev是细胞间通讯的关键介质，在免疫反应的调节中发挥着至关重要的作用。ev包括外泌体、微泡和凋亡小体，携带蛋白质、碳水化合物、脂质等生物活性分子和遗传信息，包括mirna。其作为生理和病理过程的关键中介，因其体积小、免疫原性低、操作相对易用性和稳定性而在癌症治疗中具有重大临床潜力。外泌体是细胞分泌到细胞外的成分，目前主要用于疾病诊断。由于外泌体的产量比较低，至今还无法大量制备，严重制约着其作为药品的产业化。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有技术中的问题，提供人脐带血nk细胞分泌的细胞外囊泡的制备及应用。

2、本发明的技术方案是：

3、nk细胞的细胞外囊泡在制备治疗肿瘤的产品中的应用，所述nk细胞的细胞外囊泡为人脐带血nk细胞分泌的细胞外囊泡，所述肿瘤为乳腺癌，所述产品为食品或药品。

4、人脐带血nk细胞来源细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

5、步骤1：分血。运用密度梯度离心法，分离脐带血单个核细胞

6、步骤2：补液。通过增加nk细胞培养体积，扩大培养规模。

7、步骤3：装袋。nk细胞从培养瓶装入培养袋进一步扩增培养。

8、步骤4：将培养有细胞的培养袋与一装有新鲜培养基的培养袋混合，然后分为两袋进行进一步扩增培养。

9、步骤5：收集nk细胞的培养上清。

10、步骤6：制备浓缩的细胞外囊泡。将经过多次扩增培养细胞过程的培养基取出，制备浓缩的细胞外囊泡。

11、作为一种优选的技术方案，所述步骤1中分离脐带血单个核细胞的具体操作为：

12、(1)用10ml移液管将脐带血注入50ml 离心管中，室温 2000 rpm 离心10分钟。利用临床孕妇产后直接丢弃的脐带血为材料，获得有部分医学价值的人脐带血nk细胞以及人脐带血nk细胞的活性因子，有效避免医学伦理问题。

13、(3) 在此期间准备2支盛有15 ml ficoll的离心管和1支用于盛装血浆的离心管，并将管盖拧松。

14、(4) 用10 ml移液管将上层血浆转入新的50 ml离心管中，不须完全吸尽血浆，因界面层含有较多白细胞，过度吸取血浆，可能造成白细胞丢失。

15、(5) 用生理盐水1:1稀释血细胞沉（生理盐水：全血体积=1:1），用移液管吹打混匀。

16、(6) 将血细胞悬液缓慢加载到 ficoll 层上，要求使分层保持清晰，每管约40ml。室温1600 rpm离心20分钟。

17、(7) 检查离心后情况，正常情况下应共有四层，最上一层为盐水、血浆；其下一层为交界层细胞，主要由淋巴细胞和单核细胞组成；第三层为 ficoll；最下一层是沉淀的红细胞和粒细胞。

18、(8) 用10 ml 移液管先吸弃最上层大部分液体，尽量吸取第二层交界细胞层，转移到50 ml离心管中，一般每两管ficoll分离到的细胞并至一管，但每管细胞悬液不得超过20 ml。用生理盐水补充至45 ml，颠倒混匀，室温2000 rpm离心10分钟。

19、(9) 倾去上清，用10 ml生理盐水悬浮细胞沉淀，补生理盐水至 45 ml，颠倒混匀后，取其中500μl 细胞悬液于1.5 ml ep管中计数，室温2000 rpm离心10分钟。

20、(10) 弃上清并用约50 ml的rpmi-1640培养基重悬单个核细胞，按照1-1.5×106的密度平铺t225 培养瓶中。

21、(11) 加1ml滋养层细胞。

22、(12) 在显微镜下观察细胞的形态，然后将内有细胞悬液的培养瓶放入co2培养箱培养。

23、作为一种优选的技术方案，所述步骤2中通过增加nk细胞培养体积，扩大培养规模分离脐带血单个核细胞的具体操作为：

24、（1）培养3天后，观察细胞状态，若是含较多的细胞团且有分散的细胞，添加血浆，在显微镜下观察细胞状态和长势，向t225培养瓶内添加50 ml rpmi-1640培养基。

25、（2）培养5天后，观察细胞状态，若含有较多的细胞团或是分散的细胞，添加血浆，在显微镜下观察细胞状态和长势，向t225培养瓶内添加适量200 ml rpmi-1640培养基。

26、作为一种优选的技术方案，所述步骤3中nk细胞从培养瓶装入培养袋进一步扩增培养的具体操作为：

27、（1）培养7天后，观察细胞状态，若含有较多分散的细胞、培养基偏黄，装袋至rpmi-1640培养基终体积900 ml，并加入4ml滋养层细胞，用10 ml 注射器按照抽取5 ml细胞悬液计数。

28、作为一种优选的技术方案，所述步骤4中将培养有细胞的培养袋与一装有新鲜培养基的培养袋混合，然后分为两袋进行进一步扩增培养的具体步骤为：

29、（1）培养10天后，观察细胞状态，用10 ml注射器按照抽取5 ml细胞悬液计数，若是细胞密度大于2×106，按照细胞混悬液1:1的比例进行均分袋，向两个培养袋装rpmi-1640培养基共1500 ml。

30、（2）培养13天后，观察细胞状态，若含较多分散的细胞，用10 ml注射器抽取5 ml的细胞悬液计数，若细胞密度大于2×106，向两个培养袋中共补rpmi-1640培养基1200 ml。

31、作为一种优选的技术方案，所述步骤5中收集nk细胞的培养上清的具体步骤为：

32、（1）培养16天，回收900 ml细胞培养上清。

33、（2）培养17天，回收900 ml细胞培养上清。

34、（3）培养18天，回收900 ml细胞培养上清。

35、（4）培养19天，回收900 ml细胞培养上清。

36、作为一种优选的技术方案，所述步骤6中制备浓缩的细胞外囊泡的具体步骤为：

37、（1）用500 ml去离子水冲洗所述切向流浓缩仪器，清除管道中的气泡；

38、（2）将待浓缩的上清液放在容器中，上清液在蠕动泵的作用下通过切向流膜包，一部分从滤液排出管排出，一部分通过循环管继续参与浓缩；

39、（3）由上清液需要浓缩的倍数计算需要浓缩出上清液的含量，最终得到浓缩到相应浓度的细胞培养上清液。

40、切向流浓缩仪器（tangential flow filtration，tff）实现了人脐带血nk细胞培养上清液的浓缩工艺。与离心浓缩或死端过滤装置相比，可在更短的时间内获得更高浓度的上清液，且膜包可反复使用。

41、本发明的有益效果为：

42、（1）本发明的技术方案利用培养人脐带血nk细胞过程中的上清液，在整个制备过程中操作简单，细胞外囊泡不仅具有外泌体的特性，其产量比外泌体大十余倍，从而打通了外泌体不能量产的瓶颈。

43、（2）本发明的制备方法最大缩短了人脐带血nk细胞上清液的制备时间，最大限度提升了人脐带血nk细胞来源的活性因子的产量，便于后期的大规模生产，降低了生产成本。

44、（3）本发明不添加任何动物源蛋白组分，最大限度提升了人脐带血nk细胞分泌的细胞外囊泡的临床应用。