伪狂犬病毒的检测引物探针组、物理滴度检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及疱疹病毒的标志病毒检测方法，特别涉及一种伪狂犬病毒的检测引物探针组、物理滴度检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、根据国内外相关法规要求的规定，生物制品生产企业需要结合产品的病毒污染来源和风险，对生产工艺过程的病毒灭活清除能力进行评价，而疱疹病毒是生物制品病毒安全性评价的一类重要病毒，伪狂犬病毒作为疱疹病毒的标志病毒，是生物制品生产工艺安全性评价中重要的组成部分，现有评价方法主要为细胞病变实验、动物抗体产生实验等，方法复杂、耗时长、重复性及特异性差、灵敏度低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提高检测的特异性、重复性、灵敏度和准确度，提供一种伪狂犬病毒的检测引物探针组。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种伪狂犬病毒的检测引物探针组，所述伪狂犬病毒的检测引物探针组包括上游引物、下游引物及与上游引物接近的探针，其中，

4、所述上游引物序列为gcgcacctgctgtactttat，核苷酸序列为seq id no.3，

5、所述下游引物序列为tactggccctcgttgaacc，核苷酸序列为seq id no.4，

6、所述探针序列为cgccggcagcgcccaaagat，核苷酸序列为seq id no.5，所述探针5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团；

7、或与这些序列具有至少95％同源性的同功能序列。优选具有至少99％同源性的同功能序列。

8、本发明利用基因组抽提的方法获取伪狂犬病毒的dna，使用premix ex taq和标记有荧光素的taqman探针及引物与病毒dna混合后，进行pcr反应，期间与模板dna互补配对的taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着pcr循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，采用设定阈值求得ct值，同时利用梯度稀释已知模版浓度的dna标准品作标准曲线，即可得出待测病毒目的基因的拷贝数，经换算，即可得到其物理滴度。

9、优选地，所述上游引物的长度、所述下游引物的长度、所述探针的长度独立地为19～20bp。

10、优选地，所述上游引物的gc含量为45～55％，优选为50％。

11、优选地，所述下游引物的gc含量为50～60％，优选为58％。

12、优选地，所述探针的gc含量为65～75％，优选为70％。

13、其中，gc含量是指在dna的4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。

14、优选地，所述上游引物的tm值为50～58℃，进一步优选为55.7℃；所述下游引物的tm值为50～58℃，进一步优选为56.6℃；所述探针的tm值为63～67℃，进一步优选为65.9℃。

15、作为优选，所述的荧光报告基团为fam；所述的荧光淬灭基团为mgb。

16、作为优选，所述上游引物、下游引物的工作浓度为10μm，所述探针的工作浓度为2.5μm。

17、一种非诊断或治疗目的伪狂犬病毒的物理滴度检测方法，该方法包括以下步骤：

18、s1、以多个浓度的含有伪狂犬病毒特异性糖蛋白gp50基因片段的线性化质粒dna标准品作为模板，采用权利要求1所述的检测引物探针组对所述质粒dna模板进行荧光定量pcr反应，采集荧光信号后建立标准曲线；

19、s2、将采集的所述荧光信号代入标准曲线生成的公式中计算，得到待测样品伪狂犬病毒的物理滴度检测结果。

20、作为优选，s1中，质粒dna标准品的构建方法是：将核苷酸序列为seq id no.2的伪狂犬病毒特异性糖蛋白gp50基因片段构建到puc-sts(addgene：#35949)载体中，得到的载体核苷酸序列为seq id no.1，同时为保证质粒在空间结构上尽量接近伪狂犬病毒基因组的空间结构，需要使用xbai内切酶对质粒进行线性化处理。

21、作为优选，s1中，所述荧光定量pcr反应的反应体系包括10μl premix ex taq(probe qpcr)2×、0.4μl所述上游引物、0.4μl所述下游引物、0.8μl所述探针、0.1～0.5μldmso、5μl dna模板、无rna酶水补足至20μl。dmso用量优选为0.4μl。

22、作为优选，s1中，所述荧光定量pcr反应的反应条件为95℃/30sec；95℃/5sec，60℃/45sec，共40个循环；并在60℃退火延伸时采集所述荧光信号。

23、作为优选，s1中，所述多个浓度的质粒dna标准品的浓度分别为2×102copies/μl、2×103copies/μl、2×104copies/μl、2×105copies/μl、2×106copies/μl、2×107copies/μl。

24、一种伪狂犬病毒的物理滴度检测试剂盒，包括本发明所述的伪狂犬病毒的检测引物探针组。进一步优选的，该试剂盒还包括qpcr反应缓冲液和dna提取试剂中的至少一种。

25、本发明与现有技术相比具有下列优势：

26、1、特异性强，本发明所用引物探针基于伪狂犬病毒特异性糖蛋白gp50的基因片段设计，在生产工艺安全性评价中常用的另三种标志病毒(异嗜性小鼠白血病病毒、呼肠孤病毒、鼠细小病毒)中无同源序列，且经验证无检测信号产生；

27、2、重复性高，线性范围内高中低浓度重复性＜20％；

28、3、准确度好，线性范围内高中低浓度准确度回收率在100％～140％之间；

29、4、灵敏度高，在满足线性、准确度、重复性的前提下，灵敏度可达2.0×101copies/μl。

技术特征：

1.一种伪狂犬病毒的检测引物探针组，其特征在于：所述伪狂犬病毒的检测引物探针组包括上游引物、下游引物及与上游引物接近的探针，其中，

2.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒的检测引物探针组，其特征在于：所述的荧光报告基团为fam；所述的荧光淬灭基团为mgb。

3.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒的检测引物探针组，其特征在于：所述上游引物、下游引物的工作浓度为10μm，所述探针的工作浓度为2.5μm。

4.一种非诊断或治疗目的伪狂犬病毒的物理滴度检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的物理滴度检测方法，其特征在于：

6.根据权利要求1所述的物理滴度检测方法，其特征在于：s1中，所述荧光定量pcr反应的反应体系包括10μlpremix ex taq(probe qpcr)2×、0.4μl所述上游引物、0.4μl所述下游引物、0.8μl所述探针、0.1～0.5μl dmso、5μldna模板、无rna酶水补足至20μl。

7.根据权利要求1所述的物理滴度检测方法，其特征在于：s1中，所述荧光定量pcr反应的反应条件为95℃/30sec；95℃/5sec，60℃/45sec，共40个循环；并在60℃退火延伸时采集所述荧光信号。

8.根据权利要求1所述的物理滴度检测方法，其特征在于：s1中，所述多个浓度的质粒dna标准品的浓度分别为2×102copies/μl、2×103copies/μl、2×104copies/μl、2×105copies/μl、2×106copies/μl、2×107copies/μl。

9.一种伪狂犬病毒的物理滴度检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的伪狂犬病毒的检测引物探针组。

10.根据权利要求9所述的物理滴度检测试剂盒，其特征在于：还包括qpcr反应缓冲液和dna提取试剂中的至少一种。

技术总结
本发明涉及疱疹病毒的标志病毒检测方法，特别涉及一种伪狂犬病毒的检测引物探针组、物理滴度检测试剂盒及检测方法。一种伪狂犬病毒的检测引物探针组，所述伪狂犬病毒的检测引物探针组包括上游引物、下游引物及与上游引物接近的探针，其中，所述上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述探针序列核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述探针5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团；或与这些序列具有至少95％同源性的同功能序列。

技术研发人员：项阳,卢孔鑫,郑成龙,毛馨悦,吴涛,朱向莹
受保护的技术使用者：浙江恒驭生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15