一种用于在酵母细胞中获得重组杆状病毒载体的组合物及应用的制作方法

本发明属于基因重组领域，更具体地，涉及一种用于在酵母细胞中获得重组杆状病毒载体的组合物及应用。

背景技术：

1、重组腺相关病毒(raav)是细小病毒科(parvoviridae)家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒。由于具有宿主范围广、免疫原性低、安全性高、可介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。

2、腺相关病毒(aav)基因组是线性单链dna分子，具有少于约5,000个核苷酸(nt)长度。末端反向重复序列(itr)侧邻非结构复制蛋白(rep)和结构蛋白(vp)的单一核苷酸编码序列。itr自我互补并且其构成使得能够形成能量稳定的分子内双链t形发夹。这些发夹结构作为病毒dna复制的起始点发挥作用。rep基因编码rep蛋白rep78、rep68、rep52以及rep40。rep78及其剪接变体rep68从自p5启动子转录的mrna翻译而来。rep52及其剪接变体rep40从自p19启动子转录的mrna翻译而来。cap基因编码vp蛋白vp1、vp2以及vp3。这些蛋白形成衣壳，由cap基因自p40启动子转录产生的两种剪接的mrna合成。

3、最近几年，aav由于其能有效感染细胞、整合入人类基因组的单个染色体位点并对人类具有较低的致病危险，而成为基因治疗的优选病毒载体。鉴于这些优点，重组腺病毒相关病毒(raav)目前用于乙型血友病、恶性黑色素瘤、囊性纤维化病以及其他疾病的基因治疗临床试验。

4、用于在昆虫细胞中制备aav的aav序列可衍生自任何aav血清型的基因组。通常，aav血清型具有在氨基酸和核酸水平的显著序列同一性的基因组序列，提供实质上相同的一系列遗传功能，产生物理和功能上基本相同的病毒体，并通过实际上相同的机制复制和装配。

5、科学家已开发了利用杆状病毒感染昆虫细胞的能力的生产系统，即将提供rep、cap和itr核心表达元件分别通过tn7重组整合到3种不同的杆状病毒载体中，需要用这3种重组杆状病毒载体共感染昆虫细胞，以制备raav(urabe等，2002，hum.gene ther.13:1935-1943；us20030148506；us20040197895)。在此基础上，简化为2种昆虫杆状病毒的的生产系统进一步产生，即将rep和cap表达框整合到一种昆虫杆状病毒载体中(smith等，2009，mol.ther.17:1888-1896)。然而，两杆状病毒共同感染细胞效率较低，无法充分利用每个细胞的产能，而且感染是个随机的过程，容易产生不含核酸的空壳缺陷raav颗粒，制备工艺条件优化起来比较复杂，不同批次制备的raav质量不稳定。

6、在1982年，dr.max d.summers,and dr.gale smith等人研究提出了bacpak杆状病毒表达系统，该系统通过在acmnpv的orf1629和orf603基因位点各引入一个bsu36 i酶切位点构建了一种经bsu36 i酶切后线性化的复制缺陷型病毒，线性化后的病毒，由于缺失了必须基因orf1629，无法产生有感染活性的病毒，将拯救重组dna转移载体与线性化的病毒共转染宿主昆虫细胞，同源重组后获得重组杆状病毒。然而，由于bsu361不能100％切割病毒dna使之线性化，重组病毒仍需要进行空斑筛选，耗时耗力。

7、随后，lee等人研究提出了bac-to-bac杆状病毒表达系统，该系统在acmnpv的多角体基因位点引入bac人工染色体元件，该元件含有mini-f复制子和tn7转座位点，使得杆状病毒dna能在细菌中进行复制，同时能通过tn7转座将外源基因插入到病毒基因组中，获得重组杆状病毒。虽然该系统不需要进行空斑筛选，但需要在细菌中进行转座重组筛选，同样耗时耗力。且通过该系统获得的重组杆状病毒在连续传代中存在不稳定的现象。

8、因此，又在此基础上进一步开发了杆状病毒系统(one bac system)，将rep、cap和itr核心表达元件整合到一种杆状病毒载体中(cn103827306a；cn112553257a)。然而，杆状病毒系统的构建需要通过一次tn7转座和一次red同源重组，或两次red同源重组将rep、cap和itr整合到一种杆状病毒载体中，费时费力，且每次整和都会引入额外的抗性基因筛选标记，增加了安全风险。

9、cas9蛋白是一种核酸内切酶，借助sgrna的部分序列与靶dna位点进行碱基配对，能够引导cas9结合到这个靶位点上并进行切割。当cas9与靶基因位点结合时发生了构象变化，核酸酶功能区对靶标dna的反向链进行定位切割。cas9介导的dna切割最后结果是目标dna(pam序列上游约3～4个核苷酸)的双链断裂(double strand break，dsb)。被称作cas9-sgrna系统。该机制使得cas9蛋白有使得环状基因线性化，进行基因编辑的能力。

技术实现思路

1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种产生重组杆状病毒载体的组合物及应用，从而解决现有技术中筛选耗时耗力、质量不稳定等技术问题。

2、为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于在酵母细胞中获得重组杆状病毒载体的组合物，包括杆状病毒载体以及一或多个重组片段；

3、其中，所述杆状病毒载体包括

4、用于维持所述杆状病毒载体复制和遗传的酵母复制元件，

5、以及分别与一或多个所述重组片段对应的一或多个目的位点；

6、所述目的位点用于在核酸内切酶的作用下使得所述杆状病毒载体线性化，从而与所述重组片段发生同源重组；

7、所述重组片段从5’端至3’端包括目的位点的上游序列，目的基因片段以及目的位点的下游序列，且至少一个所述目的基因片段上带有外源基因。

8、优选地，所述酵母复制元件为cen和ars。

9、优选地，所述外源基因为编码药物多肽或蛋白的基因。

10、优选地，所述目的位点为ac3、ac29、ac33、ac42、ac49、ac63、ac18、ac83、ac91、ac96、ac126、ac127、ac130或ac152。

11、优选地，所述重组片段与对应的所述目的位点的数量为多个，且相邻所述目的位点之间的距离小于10k pb。

12、优选地，还包括位于所述重组片段的目的基因片段上的细小病毒cap基因表达盒、rep基因表达盒和itr核心表达元件；

13、所述cap基因表达盒、所述rep基因表达盒和所述itr核心表达元件非位于同一重组片段上，所述外源基因在所述itr核心表达元件内。

14、优选地，所述核酸内切酶为cas9蛋白。

15、按照本发明的另一方面，还提供了一种利用上述组合物获得重组杆状病毒载体的方法以及使用该方法生产的重组杆状病毒。

16、按照本发明的另一方面，还提供了一种包括上述重组杆状病毒载体的细胞。

17、优选地，所述细胞为昆虫细胞或酵母细胞。

18、按照本发明的另一方面，还提供了一种利用上述细胞生产的重组杆状病毒或重组腺相关病毒。

19、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

20、1.该组合物能通过一次重组在多个目的位点同时插入目的基因片段，获得能在酵母细胞中稳定复制和遗传的重组杆状病毒载体；节省了生产时间和成本；

21、2.重组过程不需要进行空斑筛选或在细菌中进行重组筛选，省时省力；

22、3.在重组目的基因的过程中，不引入额外的抗性基因筛选标记。