一种新型的比率型双光子荧光探针平台的构建与应用

本发明属于荧光探针，具体地，涉及一种新型的比率型双光子荧光探针平台的构建与应用。

背景技术：

1、在生命体系中，除了具有各种功能的蛋白质和核酸等生物大分子外，一些生物相关的小分子、离子也广泛参与并调节了相关生理或病理活动。例如，半胱氨酸(cys)分子参与了蛋白质的合成、生物催化、信号传导等。人体内许多疾病的发生都与cys的代谢异常有关，如水肿、肝损伤、生长迟缓、阿尔兹海默症等。此外，次硝酸(hno)作为no的单电子还原形式，它能够与蛋白质上的巯基作用从而抑制乙醛脱氢酶的活性，还可以通过上调引起血管舒张的降钙素相关肽从而治疗心力衰竭。因此，有效地检测细胞中这些小分子的含量对维持人体健康具有重要意义。

2、目前，一系列的检测方法如比色法、电化学分析法、高效液相色谱法等被开发用于cys或hno的检测。尽管这些方法具有合适的灵敏度，但是，他们需要对样本进行复杂的预处理，还可能造成生物样本的损伤，因此，这些方法并不适合检测生物体系中的cys或hno。近年来，荧光探针凭借其高灵敏度、快速检测、低的样品损伤等优点被广泛用于细胞、组织以及亚细胞器中目标物的生物成像。目前已经报导了多种基于化学反应的对cys或hno特异性识别的探针。例如，研究者们基于michael加成、醛环化及脱保护机理等开发了一系列cys特异性响应的荧光探针。此外，基于二价铜离子与hno的还原反应或者氮氧化合物将hno还原成羟胺的原理以及hno与三芳基磷的反应机理设计了一系列识别hno的荧光探针。

3、但是由于这些探针通常是利用短波长的紫外或可见光作为激发光源的单光子荧光探针，它们易受光漂白、穿透深度低及背景荧光高等因素的影响，限制了这类探针在生物成像中的应用。与传统的单光子荧光成像技术相比，双光子荧光探针具有荧光背景低、光散射弱、组织损伤小以及穿透深度大(>500μm)等优点而使其有利于深层组织成像。此外，比率型荧光探针通过测量两个不同发射峰信号强度比值的变化可以有效降低诸如激光功率和探针浓度分布不均等实验因素的干扰，提高检测准确度且更适于细胞及组织中被测物的成像。

技术实现思路

1、针对上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种新型的比率型双光子荧光探针平台的构建与应用。本发明利用双光子荧光显微技术和比率型探针的优点，以萘的衍生物作为双光子供体、罗丹酚染料作为能量受体构建一个基于fret机理的比率型的双光子荧光探针平台np-rhod。通过该探针平台与不同识别基团的结合，可实现对cys或hno等小分子的有效检测和生物成像应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种新型的比率型双光子荧光探针平台，其结构式如下：

4、

5、所述荧光探针平台(np-rhod)的合成路线如下：

6、

7、具体合成方法为：

8、氮气保护下，将化合物1、edci(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)及dmap(4-二甲氨基吡啶)溶解在干燥的二氯甲烷中并在室温反应半小时，随后将化合物2加入反应体系中并继续在室温反应过夜；tlc检测反应完全后，向体系中加入水，用二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗，经mgso4干燥后减压蒸馏除去溶剂，粗产物经过柱层析(展开剂为二氯甲烷/乙醇＝100:1，v/v)得到红色固体，即得到所述荧光探针平台(np-rhod)。

9、进一步地，所述化合物1、edci、dmap、化合物2、二氯甲烷和水的用量之比为0.5mmol:0.5mmol:0.25mmol:0.6mmol:10ml:10ml。

10、本发明的另一个目的在于提供一种上述荧光探针平台(np-rhod)的应用，通过与hno的识别基团结合得到了hno响应的比率型双光子荧光探针p-np-rhod。并且本发明考察了在加入as(hno的来源)前后探针的紫外吸收光谱的变化情况，随着as浓度逐渐增加时，供体的特征吸收峰没有明显变化，然而一个峰值在511nm处的新的吸收峰出现，且其强度随as浓度的增加而增强，实现了对hno的比率型检测。

11、本发明的有益效果：

12、①本发明所构建的双光子比率型荧光探针平台中两个信号峰位移较大，与特定基团结合后可以实现对cys或hno的双通道成像，有效的消除背景干扰，提高生物成像的准确度。

13、②该平台具有普适性，只需连接不同的识别基团，就可以对诸如次硝酸、多硫化氢、双氧水等其它具有生理活性的分子进行响应。

技术特征：

1.一种新型的比率型双光子荧光探针平台，其特征在于，其结构式如下：

2.根据权利要求1所述的一种新型的比率型双光子荧光探针平台，其特征在于，合成路线如下：

3.根据权利要求1所述的一种新型的比率型双光子荧光探针平台，其特征在于，具体合成方法为：

4.根据权利要求3所述的一种新型的比率型双光子荧光探针平台，其特征在于，所述化合物1、edci、dmap、化合物2、二氯甲烷和水的用量之比为0.5mmol:0.5mmol:0.25mmol:0.6mmol:10ml:10ml。

5.根据权利要求3所述的一种新型的比率型双光子荧光探针平台，其特征在于，柱层析提纯中展开剂为二氯甲烷与乙醇的混合液，且二者的体积比为100:1。

6.根据权利要求1-5任一项所述的比率型双光子荧光探针平台在对cys或hno小分子的有效检测和生物成像中的应用。

技术总结
本发明公开了一种新型的比率型双光子荧光探针平台的构建与应用，属于荧光探针技术领域。本发明利用双光子荧光显微技术和比率型探针的优点，以萘的衍生物作为双光子供体、罗丹酚染料作为能量受体构建一个基于FRET机理的比率型的双光子荧光探针平台Np‑Rhod。通过该探针平台与不同识别基团的结合，可实现对Cys或HNO等小分子的有效检测和生物成像应用。

技术研发人员：祝小艳,唐佳伟,尹曦尧,彭卓睿
受保护的技术使用者：湖南城市学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15