一种与海门山羊初生重繁殖性状相关的InDel分子标记及其应用

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及一种与海门山羊初生重繁殖性状相关的indel分子标记及其应用。

背景技术：

1、优良品种是现代畜牧业发展的基石，对改善动物经济性状、提升养殖业的生产效益具有重要意义。传统育种方法主要针对表型进行剖析与选择，速度慢、成本高、效率低，而基于分子标记的辅助育种技术能弥补这些不足，即通过检测dna分子标记来检测目的基因，从而达到选择目标性状的目的。插入-缺失标记(insertion-deletion，indel)是最常见的分子标记之一，指基因组中一定数量核苷酸的插入或缺失，在真核生物基因组中分布广泛、稳定性好、准确性高，且易于检测，在分子标记辅助育种中发挥着重要作用。

2、海门山羊为皮、毛、肉兼优的江苏地方山羊品种，是我国138个国家级畜禽遗传资源保护品种之一。随着我国人们生活水平的提高，居民对羊肉及其相关制品的需求量不断增加。初生重性状是母羊繁殖性能的重要体现，母羊繁殖性能的高低直接影响羊场的经济效益。初生重性状受多个微效基因控制，有关其分子标记的挖掘与利用还比较少。因此，筛选与山羊高繁相关的分子标记，对提高母羊的繁殖性能具有重要的作用，也对加快肉羊产业发展、提高农民收入以及改善居民肉类消费结构具有极其重要的意义。

3、lgr4又名gpr48，是富含亮氨酸重复g蛋白偶联受体家族(lgrs)的一员，为wnt/β-catenin信号通路的关键靶基因，与其配体r-spondin之间具有很强的亲和力，两者结合后能够增强wnt信号通路的转导效率(刘晓瑞,2016)。大量研究表明，lgr4与胚胎发育、乳腺发育、干细胞活性、毛囊生长、胆囊和骨的形成有关，并在机体生殖调控中具有重要意义。lgr4缺失可以导致生殖细胞在减数第一次分裂时停止，并发生凋亡。

4、有关lgr4多态性的研究均集中在人类的生理表型以及疾病研究方面。lgr4突变会影响wnt/β-catenin信号传导，导致gnrh神经元发育缺陷，最终造成青春期延迟的表型。styrkarsdottir等发现，lgr4 c.376c>t突变与低骨密度和骨质疏松性骨折密切相关(styrkarsdottir et al.,2013)。除此之外，该突变位点还与电解质失衡、月经初潮推迟、睾酮水平降低、皮肤鳞癌和胆道癌症风险增加等有关。但lgr4多态性位点在家畜中仍未见报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术在海门山羊繁殖性状选育中的不足，本发明的目的在于提供一种与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记及其应用。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、第一方面，本发明要求保护与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记或检测与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记的物质在海门山羊繁殖性状筛选或/和育种中的应用：

4、所述与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记为lgr4 61bp indel，所述的lgr461bp indel定位为第15号染色体第24846528bp，为一处61bp的缺失：gaagtagtccatgtaagctatcagaaaaggctttatggaagaggtgaagtgtttcaaaa tta→g。

5、进一步的，所述的繁殖性状为羔羊初生重。

6、进一步的，所述的海门山羊繁殖性状筛选和/或育种为利用上述lgr4 61bp indel分子标记鉴定海门山羊的羔羊初生重性状。

7、进一步的，所述的海门山羊繁殖性状筛选和/或育种还包括利用上述lgr4 61bpindel分子标记调节海门山羊的羔羊初生重。

8、进一步的，所述物质含有(或为)扩增包含所述indel分子标记在内的海门山羊基因组dna片段的pcr引物。

9、在本发明的具体实施方式中，所述的pcr引物包含上游引物f1和下游引物r1：

10、上游引物f1：5’-aaggcagtaagtaagcaccag-3’；

11、下游引物r1：5’-tgtttccattgtttccccata -3’。

12、进一步的，以待测海门山羊血液基因组dna为模板，利用上述的pcr引物进行pcr扩增，根据pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果确定所述indel分子标记的基因型；保留ii基因型个体，淘汰dd基因型个体，逐代提高海门山羊的羔羊初生重。

13、lgr4 61bp indel不同基因型对海门山羊第一胎初生重有显著影响，对第二胎初生重和平均初生重有极显著影响，ii基因型母羊所产的第一胎羔羊初生重极显著高于dd基因型个体的后代，第二胎羔羊初生重极显著高于dd基因型和id基因型个体的后代，平均初生重极显著高于id基因型个体的后代。

14、在本发明的具体实施方式中，lgr4 61bp indel基因型的判定：在172bp处呈现单一条带的为dd基因型，在233bp处呈现单一条带的为ii基因型，在172bp和233bp处各存在一条带的为id基因型。

15、第二方面，本发明要求保护一种海门山羊繁殖性状的遗传育种改良方法，以待测海门山羊血液基因组dna为模板，利用上述的pcr引物进行pcr扩增，根据pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果确定上述indel分子标记的基因型；保留ii基因型个体，淘汰dd基因型个体，逐代提高海门山羊的初生重。

16、进一步的，上述的方法中，lgr4 61bp indel不同基因型对海门山羊第一胎初生重有显著影响，对第二胎初生重和平均初生重有极显著影响，ii基因型母羊所产的第一胎羔羊初生重极显著高于dd基因型个体的后代，第二胎羔羊初生重极显著高于dd基因型和id基因型个体的后代，平均初生重极显著高于id基因型个体的后代。

17、在本发明的具体实施方式中，通过琼脂糖凝胶电泳结果判定基因型。所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2％的琼脂糖凝胶。

18、在本发明的具体实施方式中，lgr4 61bp indel基因型的判定：在172bp处呈现单一条带的为dd基因型，在233bp处呈现单一条带的为ii基因型，在172bp和233bp处各存在一条带的为id基因型。

19、在本发明的具体实施方式中，所述pcr扩增的反应体系为20μl，包含：2×taq plusmaster mixⅱ10μl；上下游引物各0.8μl；模板dna 1μl；去离子水7.4μl；所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；pcr结束后4℃保存。

20、在本发明的具体实施方式中，选择ii基因型个体作为海门山羊育种时的亲本可提高第一胎初生重、第二胎初生重和平均初生重。ii基因型个体母羊所产第一胎羔羊初生重比dd基因型个体高0.25kg，比id基因型个体高0.05kg。ii基因型个体母羊所产第二胎羔羊初生重比dd基因型个体高0.24kg，比id基因型个体高0.13kg。ii基因型个体母羊所产羔羊的平均初生重比dd基因型个体高0.12kg，比id基因型个体高0.10kg。

21、上述的与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记也属于本发明的保护范围。

22、上述的用于检测所述的与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记的物质也属于本发明的保护范围。

23、进一步的，所述物质为扩增包含所述indel分子标记在内的海门山羊基因组dna片段的pcr引物，或含有所述pcr引物的试剂盒。所述pcr引物的具体核苷酸序列如上所述。

24、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

25、本发明首次在lgr4基因发现了影响海门山羊初生重的有效indel分子标记，利用本发明提供的试剂盒，通过pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳检测分子标记的基因型，方法简单快速、准确性高且价格低廉。利用本发明的分子标记对海门山羊进行筛选，保留ii基因型个体进行遗传选育，淘汰dd基因型个体，可提高海门山羊的繁殖性能，加快海门山羊的育种进展，具有很高的应用价值。