一种与海门山羊繁殖性状相关的InDel分子标记及其应用

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及一种与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记及其应用。

背景技术：

1、我国是世界第一养羊大国，养羊业的发展对提高我国经济以及人民生活水平具有重要意义。近年来，我国羊肉市场需求量不断增加，甚至出现供不应求的现象，然而由于养殖方式落后、生产基础较差，目前养羊业的发展仍不能满足人们的需求。繁殖性状是一个极其复杂的数量性状，由多生物学过程共同调控。繁殖性能的高低直接影响养殖场的经济效益，因此，通过科学的方式提升肉羊的繁殖能力是我国养羊业的重要任务。

2、分子标记辅助选择育种技术，即通过研究分子标记来辅助选择其所控制的性状，从而达到选择某一特定优势性状的目的，为畜禽分子育种技术体系的重要组成部分。插入/缺失(insertion/deletion，indel)是指基因组序列中一段碱基出现小于50bp插入或者缺失的情况，其在检测时具有快速性、简便性与可操作性的优点，为目前应用较广泛的分子标记。

3、akt为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白，又称为蛋白激酶b，为一类信号转导分子，在pi3k/akt信号通路中发挥关键作用。akt存在三种亚型，分别为akt1、akt2和akt3，每一种亚型的结构基因和功能基因都存在高度同源的序列，相似度高达80％(hinz&jücker,2019)。有大量证据表明，akt功能涉及细胞存活、细胞凋亡以及细胞增殖等。akt3主要定位于细胞核中，并广泛参与机体的生殖调控。

4、在羊上，luo等(luo et al.,2021)从大足黑山羊妊娠早期滋养层转录组中筛选发现akt3为调控胎盘发育的候选基因。shariati等(shariati gazgazareh,masoudi,vaeztorshizi,ehsani,&mosavian,2023)利用rna-seq发现akt3为影响shal绵羊繁殖和生育能力的重要基因。大量circrna在绵羊卵巢卵泡期和黄体期中存在差异表达，从而影响绵羊的繁殖表型。liu等(liu et al.,2021)通过wgcna分析发现，akt3为导致高繁绵羊和低繁绵羊卵泡期和黄体期差异的关键基因。

5、有关akt3基因多态性的探索在人类疾病，特别是癌症中有大量报道，在家畜优良性状选育中也有较广泛的研究。getmantseva等(getmantseva et al.,2020)在pigqtldb中发现akt3基因中一处snp突变与猪的产仔性状有关，能作为提高猪产仔总数以及仔猪存活率的有效基因。akt3基因c.1213a>c snp突变与欧洲大白兔生长性状相关，aa基因型个体各阶段体重均显著高于cc基因型(王利娜,陈仕毅,贾先波,王杰,&赖松家,2016)。akt3基因snp位点还与与猪背膘厚等性状相关，暗示该基因可能还与脂肪沉积以及肌肉发育有关(陈亚楠,2015)。除此之外，akt3基因snp突变还与肉鸡肌纤维数量、鸭产蛋量等有关，可作为相关性状选育的分子标记。尽管akt3多态性在多种家畜中有研究，但均集中在snp位点上，有关其indel位点在山羊繁殖性状中的研究还未曾报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术在海门山羊繁殖性状选育中的不足，本发明的目的在于提供一种与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记及其应用。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、第一方面，本发明要求保护与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记或检测与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记的物质在海门山羊繁殖性状筛选或/和育种中的应用：

4、所述与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记为akt3 25bp indel或/和akt329bp indel；所述的akt3 25bp indel定位为第16号染色体第32045271bp，为一处25bp的插入：g→gtatcctctgtatcaagtttgtctcc；所述的akt3 29bp indel定位为第16号染色体第32104221bp，为一处29bp的缺失：ggagtagataattacctactctttaaata a→a。

5、进一步的，所述的繁殖性状为产羔数和/或羔羊初生重。

6、进一步的，所述的海门山羊繁殖性状筛选和/或育种为利用上述akt3 25bp indel或/和akt3 29bp indel两个分子标记鉴定海门山羊的产羔数性状和/或初生重性状。

7、进一步的，所述的海门山羊繁殖性状筛选和/或育种还包括利用上述akt3 25bpindel或/和akt3 29bp indel两个分子标记调节海门山羊的产羔数和/或初生重。

8、进一步的，所述物质含有(或为)扩增包含所述indel分子标记在内的海门山羊基因组dna片段的pcr引物。

9、在本发明的具体实施方式中，所述的pcr引物包含引物对akt3 25bp indel p1和引物对akt3 29bp indel p2；

10、所述引物对akt3 25bp indel p1的上游引物f1和下游引物r1的核苷酸序列分别如下所示：

11、上游引物f1：5’-agcccattaccttgtaccttt-3’；

12、下游引物r1：5’-gttccattcattcagccagtc-3’。

13、所述引物对akt3 29bp indel p2的上游引物f2和下游引物r2的核苷酸序列分别如下所示：

14、上游引物f2：5’-ttcagagtttgagtaggcact-3’；

15、下游引物r2：5’-cctaagggaatacataagaaat-3’。

16、进一步的，以待测海门山羊血液基因组dna为模板，利用上述的pcr引物进行pcr扩增，根据pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果确定所述indel分子标记的基因型；根据实际生产情况中需要改善的繁殖性状，选择相应的基因型亲本进行遗传选育；

17、akt3 25bp indel与海门山羊第二胎产羔数和羔羊平均初生重显著相关，dd基因型母羊第二胎产羔数显著高于id基因型和ii基因型母羊，ii基因型母羊所产羔羊的平均初生重显著高于dd基因型母羊；

18、akt3 29bp indel与海门山羊第二胎初生重显著相关，ii基因型母羊所产羔羊的第二胎初生重显著高于dd基因型母羊。

19、在本发明的具体实施方式中，akt3 25bp indel基因型的判定：在258bp处呈现单一条带的为dd基因型，在283bp处呈现单一条带的为ii基因型，在258bp和283bp处各存在一条带的为id基因型；

20、akt3 29bp indel基因型的判定：在122bp处呈现单一条带的为dd基因型，在151bp处呈现单一条带的为ii基因型，在122bp和151bp处各存在一条带的为id基因型。

21、第二方面，本发明要求保护一种海门山羊繁殖性状的遗传育种改良方法，以待测海门山羊血液基因组dna为模板，利用上述的pcr引物进行pcr扩增，根据pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果确定上述indel分子标记的基因型；根据实际生产情况中需要改善的繁殖性状(产羔数和/或羔羊初生重)，选择上述位点的合适基因型亲本进行遗传选育。

22、进一步的，上述的方法中，akt3 25bp indel与海门山羊第二胎产羔数和羔羊平均初生重显著相关，dd基因型母羊第二胎产羔数显著高于id基因型和ii基因型母羊，ii基因型母羊所产羔羊的平均初生重显著高于dd基因型母羊；

23、akt3 29bp indel与海门山羊第二胎初生重显著相关，ii基因型母羊所产羔羊的第二胎初生重显著高于dd基因型母羊。

24、在本发明的具体实施方式中，通过琼脂糖凝胶电泳结果判定基因型。所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2％的琼脂糖凝胶。

25、在本发明的具体实施方式中，akt3 25bp indel基因型的判定：在258bp处呈现单一条带的为dd基因型，在283bp处呈现单一条带的为ii基因型，在258bp和283bp处各存在一条带的为id基因型；

26、akt3 29bp indel基因型的判定：在122bp处呈现单一条带的为dd基因型，在151bp处呈现单一条带的为ii基因型，在122bp和151bp处各存在一条带的为id基因型。

27、在本发明的具体实施方式中，所述pcr扩增的反应体系为20μl，包含：2×taq plusmaster mixⅱ10μl；上下游引物各0.8μl；模板dna 1μl；去离子水7.4μl；所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；pcr结束后4℃保存。

28、在本发明的具体实施方式中，在akt3 25bp indel选择dd基因型个体作为海门山羊育种时的亲本，可提高第二胎的产羔数，dd基因型个体的第二胎产羔数比ii基因型个体多0.98只，比id基因型个体多0.38只；选择ii基因型个体作为海门山羊育种时的亲本，可提高母羊所产羔羊的平均初生重，ii基因型个体母羊所产羔羊的平均初生重比dd基因型个体高0.2kg，比id基因型个体高0.14kg。

29、在akt3 29bp indel选择ii基因型个体作为海门山羊育种时的亲本，可提高母羊所产第二胎羔羊的初生重，ii基因型个体母羊所产羔羊第二胎初生重比dd基因型个体高0.24kg，比id基因型个体高0.13kg。

30、上述的与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记也属于本发明的保护范围。

31、上述的用于检测所述的与海门山羊繁殖性状相关的indel分子标记的物质也属于本发明的保护范围。

32、进一步的，所述物质为扩增包含所述indel分子标记在内的海门山羊基因组dna片段的pcr引物，或含有所述pcr引物的试剂盒。所述pcr引物的具体核苷酸序列如上所述。

33、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

34、本发明首次在akt3基因发现了影响海门山羊产羔数与初生重的有效indel分子标记，利用本发明提供的试剂盒，通过pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳检测分子标记的基因型，方法简单快速、准确性高且价格低廉。利用本发明的分子标记，根据实际生产情况中需要改善的繁殖性状(产羔数和/或羔羊初生重)，对海门山羊进行筛选，淘汰不利基因型的个体，选择合适基因型亲本进行遗传选育，可提高海门山羊的繁殖性能，加快海门山羊的育种进展，具有很高的应用价值。