干细胞制剂的免疫调控功能的评估方法

本公开涉及生物医学工程产业领域，具体涉及一种干细胞制剂的免疫调控功能的评估方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、干细胞是一类具有自我更新/多向分化潜能和独特免疫调控功能的细胞，以干细胞为代表的细胞治疗突破药物、手术两种传统治疗方式，已成为生物医学领域最前沿、最有前景的疾病干预策略。当前全球各国已批准上市了十余款干细胞产品，以间充质干细胞为主，而国内目前尚无干细胞产品上市，但是为了保障正规、有序、安全、健康的细胞治疗产业前景，国家制定一系列政策法规，推动干细胞治疗的临床进展，主要从干细胞临床研究备案项目和干细胞新药临床研究两个方向进行。。监管政策的完善落地将规范干细胞治疗的临床转化，并指引该领域的发展方向。

3、除自我更新和多向分化潜能之外，干细胞具有独特的免疫学特性，并展示出独特的免疫调控功能。目前干细胞已被用于治疗多种类型的免疫异常如自身免疫反应、炎症失控所致的疾病，如1型糖尿病、系统性红斑狼疮(sle)、急慢性移植物抗宿主反应(gvhd)等。此外，科研人员正在积极推进包括恢复期血浆、干细胞等在重症治疗方面的临床疗效的研究探索，尤其有望在预防、改善重症“炎症瀑布反应”及肺纤维化方面具有其他治疗都无法替代的优势。当前，国内外大量临床前研究已经验证了干细胞治疗自身免疫疾病的有效性和安全性，并有不少研究进入ii-iii期临床试验阶段。近年来，国际上逐步将干细胞的免疫调控功能当作干细胞作为治疗产品的关键有效性属性，并形成共识、提出了一些建设性意见，如国际细胞治疗协会(international society of cell therapy，isct)于2013年建议针对干细胞的各项免疫调控功能建立一套可靠的、重复性好的标准化检测技术，用于评价干细胞作为治疗产品的质量。而我国在《干细胞临床研究管理办法》出台的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》中也明确提出“免疫调控功能作为干细胞生物学有效性的质量评价内容”。

4、然而，发明人发现，当前国内外针对干细胞制剂的质量检验一般只涉及一般生物学属性(数量、活性、增殖能力等)、微生物安全性(细菌、病毒、真菌和内毒性检测等)、生物学安全性(抗原性、致瘤性等检测)，针对细胞制剂的生物学有效性的质量检测手段相对缺乏，目前也更多集中在表明分子标记物、诱导分化功能检测，尚缺少免疫调控性能这一关键的细胞生物学性能评价。尤其是针对用于糖尿病、自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等)及急慢性炎症性疾病(如新型冠状病毒covid-19、sars冠状病毒、埃博拉病毒或者h7n9流感病毒等感染引起的全身炎症反应sirs)等，免疫调控性能，而不是定向分化能力，才是干细胞最重要的治疗机制。对于用于这部分疾病治疗的细胞制剂，科学客观地评估其免疫调控性能至为重要。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的是提供一种评估干细胞免疫调控功能的标准化方案。本方法基于混合淋巴细胞反应的基本原理，能够评价干细胞对总淋巴细胞增殖的抑制能力，作为干细胞免疫调控功能的基本性能评估；也能进一步评估干细胞对cd4+t淋巴细胞亚群增殖分化的调控效能，以及干细胞对不同免疫细胞释放炎症因子等方面的调控能力。本发明所述方法是一种可靠、重复性好的标准化检测方法，可作为全面综合反映干细胞质量的必要内容，能够反映干细胞制剂的生物学有效性。

2、具体地，本发明的技术方案如下所述：

3、本发明提供了一种评估干细胞免疫调控功能的方法，其包括：基于免疫磁珠分选(magnetic-activated cell sorting，macs)分选接受干细胞制剂的受体(即接受干细胞治疗的个体)或同一标准供体(作为参照)的效应细胞，采用抗体包被的扩增磁珠进行标准化的效应细胞扩增，基于羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carbo xy fluor esce indiacetate succinimidylester，cfse)染色标记效应细胞、流式细胞术评估在待检测干细胞单细胞混悬液内混合培养的效应细胞的增殖，以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞免疫调控功能。

4、具体地，本发明所述的评估干细胞免疫调控功能的方法包括步骤：分离制备效应细胞；cfse标记效应细胞；效应细胞接种；效应细胞与待检测干细胞混合培养；流式细胞术检测效应细胞在混合细胞中的增殖情况；以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞的免疫调控功能。

5、本发明所述效应细胞为pbmcs(人外周血单个核细胞)或tresp细胞(效应性t细胞，此处不是指effector t cell-效应t细胞，而是指t细胞中可能被干细胞调控的效应细胞)。

6、在本发明的一些实施方式中，所述pbmcs的分离方法包括：取分离好的干细胞制剂受体(即将接受干细胞输注治疗的个体)的pbmcs，去除悬浮细胞中的细胞团，离心，弃干上清液去除死细胞，即得；其中，在一些实施方式中，所述去除悬浮细胞中细胞团的方法可采用本领域的常规方法，或者可采用过30um尼龙网目的方法。

7、在本发明的一些实施方式中，tresp细胞采用t细胞分选试剂盒制备。所述t细胞分选试剂盒可用于调节性t细胞、效应性t细胞tresp的分选，可通过购买获得。

8、在本发明的一些实施方式中，所述tresp包括但不限于cd4+cd25-t细胞，而cd4+cd25-t细胞的制备方法包括：标记非cd4+细胞，抗体标记cd25+细胞，ms柱阴选tresp细胞。

9、在一些具体的实施方式中，其操作过程：

10、标记非cd4+细胞：用90μl macs buffer重悬(每107细胞)后，加入10μl biotinlabeled cocktail抗体，混匀，4℃孵育10min；加入20μl anti-biotin microbeads，4℃孵育15min；加入1ml macs buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清；加500μl buffer重悬；ld分离柱阴选除去non cd4+细胞(取ld column分离柱置于磁场stand上的大分选器(separator，紫色)上，加2ml buffer润洗；加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入1ml buffer洗两遍，收集流过分离柱的所有细胞悬液(即cd4+细胞悬液，包括洗液)；

11、抗体标记cd25+细胞：上述cd4+细胞悬液300g离心10min，去上清，加入90μl buffer重悬(每107细胞)；加10μl anti-cd25microbeads(每107细胞)，充分混匀，4℃孵育15min；加1ml buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清；加500μl buffer重悬即得到抗cd25磁珠标记的细胞悬液；

12、ms柱阴选tresp细胞：取ld column分离柱置于磁场stand上的小分选器(separator，绿色)上，加500μl buffer润洗；加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入500l buffer洗3次，收集流过分离柱来的细胞悬液(即tresp细胞：cd4+cd25-细胞悬液)。而将ms柱移除磁场，置于收集的ep管，加1ml buffer立即塞上活塞将细胞悬液挤出收集到无菌ep管，可得到纯化的调节性t细胞(treg细胞，cd4+cd25+细胞)。分选得到的细胞用流式细胞仪鉴定纯度；

13、在本发明的实施方式中，效应细胞增殖情况的检测优选csfe标记评价的办法，其他如基于ldh的检测(如mtt比色法)、3h-tdr掺入法，或是brdu标记法，或许可以替代，但在本发明的研究中，csfe标记从各方面综合考虑更为优选。所述csfe标记效应细胞的过程包括：csfe存储液与pbs避光混匀，效应细胞以pbs重悬后与上述避光混匀的溶液迅速混匀；孵育、离心后去上清加入t细胞完全培养基中重悬。

14、在本发明的一些实施方式中，效应细胞以等体积的pbs重悬。

15、效应细胞的pbs重悬液与csfe存储液和pbs避光混匀液的混合体积为1:1；

16、孵育条件为：室温(25℃)避光下孵育5min；或4-10度避光孵育；

17、孵育、取300g离心5min后去上清加入2ml含10％fbs的t细胞完全培养基重悬。

18、本发明所述的csfe存储液可采用本领域常规使用的存储液，在本发明中，优选溶于dmso中的csfe，其浓度为5mmol/l。

19、在本发明的实施方式中，所述效应细胞接种的过程包括：将csfe标记的效应细胞以加入了扩增磁珠的t细胞完全培养基重悬，接种于孔板中，每组安排2×3个效应细胞复孔。

20、本发明所述扩增磁珠为抗人cd3抗体、cd28抗体预包被的磁珠。抗人cd3抗体、cd28抗体预包被的磁珠称扩增磁珠，是由于磁珠能代替抗原刺激及抗原呈递细胞(apc)接触t细胞并直接无选择地激活tcr第一信号和cd28第二信号，从而实现在无需apc呈递的情况下活化t细胞增殖。其中所述磁珠可自行制备或选购miltenyi公司的macsibeadtm或invitrogen公司的dynabeadstm。

21、在本发明的一些实施方式中，扩增磁珠颗粒数与csfe标记的效应细胞数的比值为4:1到1:1，根据效应细胞混合培养时间和预期扩增代数，优选为2:1；

22、在本发明的实施方式中，重悬后的细胞数目为5×105到1×106个细胞/ml，优选为5×105个细胞/ml；

23、在本发明的实施方式中，每孔细胞数目为1×104到1×105个细胞，根据效应细胞适宜接种密度和扩增预期，优选为5×104个细胞。

24、在本发明的一些实施方式中，所述含扩增磁珠的t细胞完全培养基的制备方法包括：在vial中充分混匀重悬磁珠，立即吸取混匀后的磁珠(4×107beads/ml)至灭菌ep管，加入等体积或至少500μl基本培养基，离心去上清或置于macs stand上，待磁珠被充分吸附到管壁后吸去液体，再以t细胞完全培养基重悬即可。在配置完全扩增培养基前，需进行磁珠清洗。

25、在本发明的实施方式中，所述效应细胞与待检测干细胞混合培养的过程包括：将待检测干细胞单细胞混悬液加入接种有效应细胞的孔板的3个复孔作为检测孔；将未经csfe标记的效应细胞的单细胞混悬液加入接种有效应细胞的孔板的另外3个复孔作为对照孔，混匀后培养。

26、在本发明的实施方式中，培养条件可采用本领域适用于培养干细胞和效应细胞的条件。在本发明的一些实施方式中，较优的培养条件为：37℃、5％co2避光以及饱和湿度条件下培养48-96h，优选48h。

27、在本发明的实施方式中，采用流式细胞术检测效应细胞在混合细胞中的增殖情况包括：收集混合培养的细胞，充分吹打分散细胞和磁珠，于强磁场中收集细胞悬液，离心去培养基，以pbs重悬后流式上机检测，选择并分析cfse阳性细胞即效应细胞的增殖细胞比例。

28、在本发明的实施方式中，所述以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞免疫调控功能按照下述公式计算效应细胞增殖被抑制率：

29、效应细胞增殖被抑制率＝(对照孔增殖细胞比例均值-检测孔增殖细胞比例均值)/对照孔增殖细胞比例均值×100％。

30、本发明的方法能够评价干细胞对效应细胞(如总体单个核细胞、某种效应性t细胞亚群等)的抑制能力，作为干细胞免疫调控功能的基本性能评估；也能进一步评估干细胞对效应细胞(比如cd4+t淋巴细胞亚群)增殖分化的调控效能，以及干细胞对不同免疫细胞释放炎症因子的调控能力。在具体的应用中，本发明的方法能够用于评估在糖尿病、自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等)及急慢性炎症性疾病(如新型冠状病毒covid-19、sars冠状病毒、埃博拉病毒或者h7n9流感病毒等感染引起的全身炎症反应sirs)等的治疗中干细胞对不同免疫细胞释放炎症因子方面的调控能力，且可重复性好、可比性好。

31、本发明的方法可实现干细胞尤其是不同批次干细胞对受体效应细胞(比如外周血单个核细胞或cd4+cd25-效应细胞)的免疫负性功能。根据临床治疗目的需要，本领域技术人员能够根据本发明的公开调整选择其他可通过抗原呈递细胞活化的细胞亚群作为效应细胞(包括但不限于cd3+t细胞亚群、cd3+cd8+t细胞亚群、cd3+cd4+t细胞亚群以及某种抗原特异性的淋巴细胞亚群等)。此外，本发明所述方法也可用于其他免疫负性调控细胞(包括但不限于调节性t细胞)等其他用于细胞治疗的细胞制剂的检测和质控。