本发明涉及多态性试剂盒，尤其是涉及高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒及其使用方法。
背景技术：
1、常见的疾病检测试剂盒包括用于特异性扩增kras基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有kras基因的第二外显子kras2或第三外显子kras3中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述kras2具有seq-id-no：1的连续核苷酸序列；所述kras3具有seq-id-no：2的连续核苷酸序列。试剂盒采用饱和探针和高分辨率熔解曲线分析技术，完成对样品基因型的判断，从而为肿瘤包括肺癌、结直肠癌的选择用药和诊断提供指导。
2、但是常见的多态性试剂盒在使用过程中，试剂盒的敏感度不够高，从而使得整个试剂盒在使用过程中检测反应时间较长，影响了反应速率。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒及其使用方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
2、本发明的技术方案是：高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒及其使用方法，所述高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒包括：样本处理液、磁珠、扩增反应试剂溶液、待检测基因测序引物和阳性对照；
3、所述待检测基因测序引为：假丝酵母菌、曲霉菌或隐球菌中的一种。
4、优选的，所述假丝酵母菌测序引物的基因序列为：
5、fam探针组探针序列(5’→3’)：ccgcgctcgcagtttcactgtatgaattcgtttatacttagacatggcgcgg，
6、5’修饰fam，3’修饰dabcyl；
7、正向引物序列(5’→3’)：tgcttgtctcaaagattaagccatg；
8、反向引物序列(5’→3’)：aactgatttaatgagccattcgcag；。
9、优选的，所述曲霉菌测序引物的基因序列为：
10、hex探针组探针序列(5’→3’)：
11、ccgcgctcgatagtgctccccgcaaacgggctcctacctacgttcactgcgcgg，
12、5’修饰hex，3’修饰dabcyl；
13、正向引物序列(5’→3’)：tcttgaaacacggaccaaggagt；
14、反向引物序列(5’→3’)：gcatagttcaccatctttcgggtc。
15、优选的，所述隐球菌测序引物的基因序列为：
16、cy5探针组探针序列：
17、(5’→3’)：ccgcgccagcgaaatgcgatacgtagtgtgaattgcatatgcgcgg，
18、5’修饰cy5，3’修饰dabcyl；
19、正向引物序列(5’→3’)：actttcaacaayggatctcttgg；
20、反向引物序列(5’→3’)：ccgcttattgatatgcttaagttcag。
21、优选的，所述样本处理液包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通x-100、2-50mg/ml氢氧化钠、5-15％海藻糖、3～7mmol/l bsa、20-80mm tris-hcl、100mmnacl，ph＝8.5-9.5。
22、优选的，所述阳性对照包括浓度分别为20ng/ul vdr foki、vdr bsmi的型基因组dna。
23、优选的，所述扩增反应试剂溶液包括扩增反应试剂a和扩增反应试剂b；
24、所述扩增反应试剂a包括vdr foki和vdr bsmi特异性扩增引物，还包括血液样品直接pcr预混液和海藻糖；
25、所述扩增反应试剂b包括：待检测基因测序前引物、待检测基因测序后引物，链置换dna聚合酶1.2ng/μl，单链dna结合蛋白3.2ng/μl，结合单链核酸的重组酶4.8ng/μl。
26、优选的，所述阳性对照包括浓度分别为20ng/ul的待检测基因测序引物型基因组dna；所述磁珠为羧基磁珠，粒径为550mm。
27、优选的，所述高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒的使用方法包括以下步骤：
28、s1:先进行dna提取，dna提取过程中先将样本中的dna提取后保存至冰箱待用；
29、s2:将所述扩增反应液与4ul待测edta抗凝全血混合均匀进行pcr扩增；
30、s3:将样本处理液120ul、5ul磁珠和35uledta抗凝全血样本混合，室温静置8min；
31、s4:将pcr扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
32、s5:将配制好的混合液加入到步骤s4中得到的pcr扩增管中，使磁珠与所述pcr反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
33、s6:配制30μlpcr扩增体系，包含：mix20μl，mg2+1.2μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，水7.0μl，模板1.0μl；
34、s7:按照下面的循环参数设置扩增仪：
35、现在90℃12min4.4℃/s的条件下预变性，
36、然后依次在90℃10s4.4℃/s,80℃15s2.2℃/s,75℃20s4.4℃/s,进行40个循环；
37、然后依次在95℃1min4.4℃/s，50℃1min2.2℃/s，60℃1s4.4℃/s，95℃0.02℃/s持续降温采集信号，最终保持在40℃保持30s，得熔解曲线；
38、s8:高分辨率熔解曲线结果分析步骤：根据步骤s8当中获得的溶解曲线对待检测基因的多态性进行检测和判读，判断样本中的基因型属于待检测基因型中的任意一种，
39、s9:对步骤s8中得到的数据结果进行记录，即可结束整个高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒的使用流程。
40、优选的，所述步骤s5中，扩增所采用的pcr管为密封薄膜的pcr管，所述扩增反应体积为20ul反应体系，20μl的pcr扩增体系中最大加入的血液量为4μl。
41、本发明通过改进在此提供高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒及其使用方法，与现有技术相比，具有如下改进及优点：
42、本发明中，通过敏感性、特异性、重复性实验验证新建立的多重荧光pcr-熔解曲线法的检测性能；显示了较高的敏感度、特异度；标本种类涉及血液、痰液、尿液、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液、新鲜肺组织等，具有较好的临床实用性。多重荧光pcr-熔解曲线法可缩短病原真菌的检测时间，有助于早期诊断ifi，从而及时治疗真菌感染，提高临床患者治愈率，同时应用高分辨率熔解曲线技术可以快速、准确地进行短dna序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；从而缩短了反应时间，提高了检测效率，为人们的检测使用带来了更为精准的检测方法，从而增加了整体使用过程中的便利性。
1.高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒，其特征在于，所述高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒包括：样本处理液、磁珠、扩增反应试剂溶液、待检测基因测序引物和阳性对照；
2.根据权利要求1所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒，其特征在于：所述假丝酵母菌测序引物的基因序列为：
3.根据权利要求1所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒，其特征在于：所述曲霉菌测序引物的基因序列为：
4.根据权利要求1所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒，其特征在于：所述隐球菌测序引物的基因序列为：
5.根据权利要求1所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒，其特征在于：所述样本处理液包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通x-100、2-50mg/ml氢氧化钠、5-15％海藻糖、3～7mmol/l bsa、20-80mm tris-hcl、100mm nacl，ph＝8.5-9.5。
6.根据权利要求1所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒，其特征在于：所述阳性对照包括浓度分别为20ng/ul vdr foki、vdr bsmi的型基因组dna。
7.根据权利要求1所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒，其特征在于：所述扩增反应试剂溶液包括扩增反应试剂a和扩增反应试剂b；
8.根据权利要求1所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒，其特征在于：所述阳性对照包括浓度分别为20ng/ul的待检测基因测序引物型基因组dna；所述磁珠为羧基磁珠，粒径为550mm。
9.根据权利要求1所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒的使用方法，其特征在于：所述高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒的使用方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的高分辨率熔解曲线法多态性试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤s5中，扩增所采用的pcr管为密封薄膜的pcr管，所述扩增反应体积为20ul反应体系，20μl的pcr扩增体系中最大加入的血液量为4μl。