一种三疣梭子蟹血蓝重组蛋白及其PtHc-640.2基因和应用的制作方法

本发明属于分子生物学，具体涉及一种三疣梭子蟹血蓝重组蛋白及其pthc-640.2基因和应用。

背景技术：

1、三疣梭子蟹(portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济动物，目前养殖面积 30 余万亩，产量达 12万吨，已成为我国海水养殖主导品种之一。由于池塘养殖环境恶化、养殖模式粗犷，三疣梭子蟹病害频发，导致养殖产量低、养殖不稳定，成为制约产业发展的“卡脖子”问题。副溶血弧菌是造成海水甲壳动物急性肝胰腺坏死病（ahpnd）的主要病原之一，同时也是导致三疣梭子蟹大规模死亡的主要病原，严重阻碍产业健康发展。

2、血蓝蛋白可以在甲壳类动物肝胰腺器官中合成，是血淋巴的主要蛋白质成分。除了氧气转运功能外，血蓝蛋白还参与维持机体的渗透压和蜕皮过程以及与能量的贮存。已发现40多种无脊椎动物具有血蓝蛋白衍生的酚氧化酶活性。血蓝蛋白能够作为抗细菌和抗真菌肽的前体发挥作用。血蓝蛋白的凝集活性可以受到病原或者环境应激物如温度的调节，并可能在生物防御中发挥重要作用。从甲壳动物血淋巴中提取到的血蓝蛋白不仅有凝集活性，还对哺乳动物红细胞具有溶血活性。

3、研究血蓝蛋白基因及其编码蛋白对理解三疣梭子蟹免疫防御机制、进行病害防治及抗病品种培育具有重要的理论和实践意义。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种三疣梭子蟹血蓝重组蛋白及其pthc-640.2基因和应用。所述基因pthc-640.2及其编码的重组蛋白对副溶血弧菌的生长具有显著地抑制效果。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种三疣梭子蟹pthc-640.2基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明还提供了一种三疣梭子蟹血蓝重组蛋白，其是由所述的pthc-640.2基因编码的，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、进一步的，所述三疣梭子蟹血蓝重组蛋白的构建步骤如下：

6、（1）合成所述的pthc-640.2基因，并设计其特异性原核表达引物，进行pcr扩增；

7、（2）将pcr扩增的产物回收后酶切，插入到质粒中，构成重组质粒；

8、（3）将所述重组质粒转入工程菌，构成重组工程菌；

9、（4）将所述重组工程菌培养后破碎，经分离、清洗、纯化后，得到重组蛋白。

10、进一步的，所述特异性原核表达引物的序列为：

11、pthc-640.2-pf：cgcggatccgctggagaagaaacactgggc；

12、pthc-640.2-pr：ataagaatgcggccgcacacgacggtccaacgggta。

13、本发明还提供了一种重组质粒，其中含有所述的pthc-640.2基因。

14、本发明还提供了三疣梭子蟹pthc-640.2基因或者重组蛋白在制备革兰氏阴性菌的抗菌剂或者抗菌药物中的应用，所述三疣梭子蟹pthc-640.2基因的核苷酸序列如seq idno.1所示；所述重组蛋白为所述的三疣梭子蟹血蓝重组蛋白。

15、进一步的，所述革兰氏阴性菌为副溶血弧菌。

16、本发明还提供了三疣梭子蟹pthc-640.2基因或者重组蛋白在制备水产动物饲料添加剂中的应用，所述三疣梭子蟹pthc-640.2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述重组蛋白为所述的三疣梭子蟹血蓝重组蛋白。

17、本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

18、1、本发明利用基因组测序获得的unigene和race技术从三疣梭子蟹中克隆到三疣梭子蟹血蓝蛋白pthc-640.2基因cdna全长序列；利用原核表达技术，获得了pthc-640.2基因的重组蛋白；体外抑菌实验证实重组蛋白pthc-640.2在0.01、0.02、0.03 mg/ml浓度下的抑菌率分别为19%、30%、48%，重组蛋白pthc-640.2对于副溶血弧菌的生长具有显著地抑制效果。

19、2、本发明的三疣梭子蟹血蓝蛋白pthc-640.2基因及其重组蛋白可生产抑菌药物，应用于三疣梭子蟹养殖过程中相关疾病的治疗，或用于饲料添加剂、保鲜剂的生产等，另外还可以为解析三疣梭子蟹免疫机制提供数据支持，并为三疣梭子蟹抗病育种、病害防治提供理论参考。

技术特征：

1.一种三疣梭子蟹pthc-640.2基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹pthc-640.2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种三疣梭子蟹血蓝重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白是由权利要求1所述的pthc-640.2基因编码的，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求2所述的三疣梭子蟹血蓝重组蛋白，其特征在于：所述三疣梭子蟹血蓝重组蛋白的构建步骤如下：

4.根据权利要求3所述的三疣梭子蟹血蓝重组蛋白，其特征在于：所述特异性原核表达引物的序列为：

5.三疣梭子蟹pthc-640.2基因或者重组蛋白在制备革兰氏阴性菌的抗菌剂或者抗菌药物中的应用，其特征在于：所述三疣梭子蟹pthc-640.2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述重组蛋白为权利要求2所述的三疣梭子蟹血蓝重组蛋白。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为副溶血弧菌。

技术总结
本发明公开了一种三疣梭子蟹血蓝重组蛋白及其PtHc‑640.2基因和应用。属于分子生物学技术领域。所述三疣梭子蟹PtHc‑640.2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的血蓝重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。体外抑菌实验证实，三疣梭子蟹血蓝重组蛋白在0.01、0.02、0.03 mg/mL浓度下的抑菌率分别为19%、30%、48%，其对于副溶血弧菌的生长具有显著地抑制效果。因此，本发明为三疣梭子蟹的病害防治、基因辅助选育奠定了基础，且在开发抗菌药物、饲料添加剂生产等方面具有潜在的应用价值。

技术研发人员：高保全,孙东方,吕建建,李玉坤,刘萍
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黄海水产研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15