高效表达超氧化物歧化酶的丝状真菌突变菌株及其应用

本技术涉及微生物表达超氧化物歧化酶，特别是涉及一株高效表达超氧化物歧化酶的丝状真菌突变菌株及其应用。

背景技术：

1、光照作为重要的环境影响因子，它能触发和协调多种生物体的生理过程。真菌利用光信号调节不同生命过程，如昼夜节律、营养生长、生殖发育、次级代谢、应激反应和致病性等。真菌通过复杂的光感应系统感知光照，该系统由能够区分特定波长和强度的光感受器组成。据报道，真菌中存在3类光受体，即感应蓝紫光的wc、vivid和隐花色素、感应绿光的视蛋白以及感应红光与远红光的光敏色素。到目前为止，大多数真菌光生物学的研究集中在蓝光受体，蓝光受体具有光修复功能，以及调节生物钟和次生代谢的功能。关于真菌中红光受体光敏色素的研究报道较少。

2、光敏色素在子囊真菌构巢曲霉(aspergillus nidulans)、粗糙脉孢菌(neurospora crassa)、烟曲霉(aspergillus fumigatus)、灰霉菌(botrytis cinerea)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)以及担子菌门的玉蜀黍黑粉菌(ustilago maydis)中有报道。构巢曲霉的光敏色素fpha缺失后，红光对δfpha有性发育和无性发育的诱导均变弱。粗糙脉孢菌含有两个光敏色素基因phy1和phy2，但phy1和phy2不受光照的调控，phy1的mrna积累仅受昼夜节律的调控。在灰霉菌的生长发育和致病性中，光敏色素bcphy2发挥重要作用，此外，bcphy2还发挥组氨酸激酶相关功能，但大多数真菌光敏色素在光感应过程中的功能还是未知的。由此推测，不同真菌光敏色素在结构上可能是保守的，但它们在各自生物学作用是不同的。

3、丝状真菌podospora anserina(p.anserina)是一种研究衰老的模式生物，p.anserina生命周期短，只有有性繁殖，没有无性繁殖。据研究报道，光对p.anserina的有性繁殖是必需的，这与光能抑制米曲霉(aspergillus oryzae)和构巢曲霉的有性发育完全相反，红光能通过影响光敏色素蛋白的构象调节构巢曲霉无性发育和有性繁殖之间的平衡。对p.anserina的基因组分析显示，它含有9个光受体基因，这可能使p.anserina能感知光照并对光照做出响应，迄今为止，在p.anserina中只有1个蓝光受体vvd被研究过，vvd基因缺失后，该物种的雌雄配子发育异常，导致有性生殖能力下降，然而，有关光照如何通过光敏色素影响丝状真菌podospora anserina的生理过程仍有待于进一步阐明。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一株新的高效表达超氧化物歧化酶的丝状真菌突变菌株及其应用。

2、本技术具体采用了以下技术方案：

3、本技术的第一方面公开了一株高效表达超氧化物歧化酶的丝状真菌突变菌株，其由野生型丝状真菌podospora anserina通过基因敲除光敏色素基因paphy1和/或paphy2形成。

4、需要说明的是，本技术中，野生型丝状真菌podospora anserina是指光敏色素基因paphy1、paphy2正常表达的菌株；丝状真菌突变菌株是指丝状真菌podospora anserina的光敏色素基因paphy1和/或paphy2不能正常表达的菌株，更具体的是指，光敏色素基因paphy1和/或paphy2不表达或弱表达的菌株。本技术中，高效表达超氧化物歧化酶是指，相对于野生型丝状真菌podospora anserina而言，丝状真菌突变菌株能够更高效的表达超氧化物歧化酶；同样的，高效表达过氧化物酶是指，相对于野生型丝状真菌podosporaanserina而言，丝状真菌突变菌株能够更高效的表达过氧化物酶。

5、还需要说明的是，本技术研究发现，丝状真菌podospora anserina的光敏色素基因paphy1、paphy2对超氧化物歧化酶(sod酶)和过氧化物酶(pod酶)的活性具有负调节作用。本技术研究证实，单基因敲除paphy1的突变菌株(标记为δpaphy1)、单基因敲除paphy2的突变菌株(标记为δpaphy2)和双基因敲除paphy1和paphy2的菌株(标记为δpaphy1δpaphy2)，比野生型丝状真菌podospora anserina具有更高的sod酶活性。本技术的一种实现方式中，突变菌株的sod酶活性最高可达野生型丝状真菌podospora anserina的2.79倍。可以理解，本技术的关键在于研究证实光敏色素基因paphy1、paphy2对sod酶和pod酶的活性具有负调节作用；基因敲除只是本技术的一种实现方式中让光敏色素基因paphy1、paphy2不表达的方式，不排除还可以采用其他方式使这两个基因不表达或弱表达，以达到高效表达sod酶或pod酶的作用。

6、本技术的一种实现方式中，突变菌株由野生型丝状真菌podospora anserina通过基因敲除光敏色素基因paphy1和paphy2形成。

7、本技术的一种实现方式中，突变菌株的保藏号为cctcc m 20231657。

8、需要说明的是，本技术研究发现，野生型丝状真菌podospora anserina光敏色素基因paphy1、paphy2的单基因突变和双基因突变都能够更高效的表达sod酶和pod酶；其中，尤其以双基因突变菌株δpaphy1δpaphy2的效果较佳。因此，本技术仅仅对双基因突变菌株δpaphy1δpaphy2进行了保藏。

9、本技术第二方面公开了本技术突变菌株在超氧化物歧化酶或过氧化物酶制备中的应用。

10、需要说明的是，本技术的突变菌株能够高效的表达sod酶和pod酶；因此，可以用于更高效的制备超氧化物歧化酶、过氧化物酶，从而提高生产效率，降低生产成本。

11、本技术的第三方面公开了一种高效表达超氧化物歧化酶的方法，包括对本技术的突变菌株进行培养。

12、本技术的一种实现方式中，高效表达超氧化物歧化酶的培养条件为，在白光、红光或黑暗条件下培养至少3天。

13、优选的，在白光或黑暗条件下培养至少3天。

14、优选的，高效表达超氧化物歧化酶的培养温度为27℃恒温培养。

15、需要说明的是，采用本技术的突变菌株能够高效表达超氧化物歧化酶，至于培养条件可以参考现有的野生型丝状真菌podospora anserina的培养条件，白光、红光或黑暗条件下培养至少3天只是本技术的一种实现方式中具体采用的培养方式，不排除还有更优的培养方式；同样的，27℃恒温培养也只是本技术的一种实现方式中具体采用的培养问题。但是，本技术研究发现，在白光或黑暗条件下培养本技术的突变菌株能够获得相对更高效的超氧化物歧化酶表达；尤其是在黑暗条件下，即在没有光照刺激的条件下，δpaphy1、δpaphy2和δpaphy1δpaphy2的sod酶活明显高于野生型，且有显著差异。本技术的一种实现方式中，黑暗条件下δpaphy1、δpaphy2和δpaphy1δpaphy2的sod酶活性分别是野生型丝状真菌podospora anserina的sod酶活性的1.94倍、2.63倍和2.79倍。

16、本技术第四方面公开了一种高效表达过氧化物酶方法，包括对本技术突变菌株进行培养。

17、本技术的一种实现方式中，高效表达过氧化物酶的培养条件为，在白光、红光或黑暗条件下培养至少5天。

18、优选的，在白光或红光条件下培养至少5天。

19、优选的，高效表达过氧化物酶的培养温度为27℃恒温培养。

20、需要说明的是，本技术高效表达过氧化物酶的培养条件也可以参考现有的野生型丝状真菌podospora anserina的培养条件。但是，本技术研究发现，不同的突变菌株高效表达过氧化物酶的培养条件有所不同；例如，单基因突变菌株δpaphy1和δpaphy2都是在红光条件下具有更高的表达效率，最高分别可达野生型丝状真菌podospora anserina的1.40倍和1.78倍；又例如，双基因突变菌株δpaphy1δpaphy2在白光条件下具有更高的表达效率，最高可达野生型丝状真菌podospora anserina的1.29倍。

21、本技术的第五方面公开了一种提高丝状真菌podospora anserina超氧化物歧化酶活性的方法，包括采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光敏色素基因paphy1和/或paphy2不表达或减弱表达。

22、本技术的第六方面公开了一种提高丝状真菌podospora anserina过氧化物酶活性的方法，包括采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光敏色素基因paphy1和/或paphy2不表达或减弱表达。

23、需要说明的是，本技术的关键在于研究发现，丝状真菌podospora anserina的光敏色素基因paphy1、paphy2对sod酶和pod酶的活性具有负调节作用；因此，原则上只要光敏色素基因paphy1、paphy2不表达或减弱表达，都能够促进sod酶和pod酶的表达，从而提高丝状真菌podospora anserina的超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性。至于具体采用的使基因不表达或弱表达的方式，可以参考现有技术，包括但不仅限于基因敲除和基因沉默。

24、本技术的有益效果在于：

25、本技术高效表达超氧化物歧化酶的丝状真菌突变菌株，即基因敲除光敏色素基因paphy1的突变菌株，基因敲除光敏色素基因paphy2的突变菌株，和基因敲除光敏色素基因paphy1和paphy2的突变菌株。本技术率先发现基因敲除光敏色素基因paphy1和/或paphy2的丝状真菌podospora anserina能够更高效的表达超氧化物歧化酶和过氧化物酶，对高效表达和制备超氧化物歧化酶和过氧化物酶具有重要意义。