一种超氧化物歧化酶、复合材料及其纯化方法、制备方法和应用

本发明涉及生物，具体涉及一种超氧化物歧化酶、复合材料及其纯化方法、制备方法和应用。

背景技术：

1、畜禽在环境胁迫、日粮变化、断奶以及病毒入侵等情况下，体内的氧化与抗氧化作用失衡，有氧代谢过程中会积累大量自由基，从而损害dna、脂质、蛋白质等细胞重要的生物大分子，导致细胞的不可逆损伤甚至死亡，并异常激活某些特定氧化还原敏感信号通路，从而导致机体产生氧化应激反应。在动物生理上主要表现为器官损伤、免疫力下降、抗氧化能力减弱、肠道微生物群落和代谢的变化等，而在动物生产上主要表现为畜禽采食量降低、生产性能下降、幼畜成活率低、种畜繁殖障碍和发病率高等，对畜禽健康和畜牧业的稳定发展带来了严重的危害。抗生素对于畜禽具有增强抗应激能力、促进机体健康和生长等重要作用，在动物生产中曾得到了广泛应用，但由于其耐药性、药物残留以及食品安全等问题，已被世界许多国家包括中国禁止使用，因此良好的替抗产品是解决当前畜禽应激的关键。

2、超氧化物歧化酶(sod)是一种抗氧化物酶，广泛存在于动物、植物、微生物中，是需氧生物体酶类抗氧化系统中最重要的抗氧化酶，在保护细胞免受过量ros积累产生的毒害中发挥着重要作用。sod能将活性氧ros中活性最高的o2-·歧化为o2和h2o2，有效清除自由基，具有特异性强、效率高的特点。sod因其突出的抗氧化能力在治疗炎症疾病、化妆品和提高植物抗逆等方面得到了广泛研究，并在医药、农业、食品工业和化妆品等行业中广泛应用。在畜牧业中，畜禽饲料中添加sod可以预防和缓解环境胁迫、营养失调、细菌或病毒入侵等负面影响引起的氧化应激，清除机体自由基，增强机体抗氧化能力和免疫力，提高幼龄动物成活率和动物健康。目前，微生物发酵生产sod具备酶产量高、安全可靠和无毒性等优势，能大幅度降低sod的生产成本，无疑是生产sod很好的选择。但目前由于许多sod因其热稳定性不好、酸耐受能力差、生物利用度低缺点限制了其广泛应用。

3、金属有机框架(mof)是由有机配体结构和金属离子自组装而成的高度结晶的多孔纳米材料。因其具有可调节的孔形态和大小、形态和生物可降解性、易合成等优点，能够有效地将蛋白质等大分子物质装载到孔内部并保持其活性，具有其他材料无法达到的发展空间。其中，沸石咪唑酸框架-8(zif-8)中包裹蛋白质可以防止对蛋白质不利的外界条件，被证明是一种很有前途的方法。特别是，zif-8直接在蛋白质表面的仿生矿化生长，已经成为一种仅使用蛋白质、锌盐和甲基咪唑直接在水中包封酶等蛋白质的方法。在水溶液中易于合成，且对酶的包封效率高。

4、现有技术中通过mof复合后的酶能够提高酶的催化活性，但目前没有能够提高酶的耐高温性能的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种超氧化物歧化酶、复合材料及其纯化方法、制备方法和应用，解决现有技术中sod酶热稳定性差的技术问题。

2、为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种超氧化物歧化酶，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、进一步地，所述超氧化物歧化酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、此外，本发明还提出一种含有上述所述编码基因的表达载体、转基因细胞系或者宿主菌。

5、另外，本发明还提出一种上述超氧化物歧化酶的纯化方法，包括以下步骤：

6、s1、将超氧化物歧化酶转大肠杆菌表达，之后转接至含卡那霉素的lb培养基活化培养，之后扩大培养至od600为0.6-0.8；

7、s2、向扩大培养后的容器中添加iptg和feso4进行诱导培养，之后将细胞破碎收集上清液即为富含超氧化物歧化酶的粗酶溶液；

8、s3、采用ni柱亲和层析法对所述粗酶溶液纯化得到所述超氧化物歧化酶。

9、另外，本发明还提出一种复合材料，包括上述超氧化物歧化酶和金属有机框架。

10、另外，本发明还提出一种上述复合材料的制备方法，包括以下步骤：

11、t1、将超氧化物歧化酶与水混合得到htsod溶液；

12、t2、在超声条件下将所述htsod溶液、2-甲基咪唑溶液、醋酸锌溶液以及甲醇溶液依次混合得到所述复合材料。

13、进一步地，在步骤t2中，混合后还包括将混合后的溶液静置，之后离心得到所述复合材料。

14、进一步地，在步骤t2中，所述静置的时间为12h以上。

15、进一步地，在步骤t2中，所述2-甲基咪唑溶液的浓度为15-16mg/ml，所述醋酸锌溶液的浓度为8-9mg/ml，所述htsod溶液的浓度为1-1.2mg/ml；所述2-甲基咪唑溶液或者所述的醋酸锌溶液的添加量为所述htsod溶液的2-2.2倍，所述甲醇溶液的添加量为所述htsod溶液的0.2-0.3倍。

16、进一步地，本发明提出一种上述超氧化物歧化酶或者上述纯化方法纯化得到的超氧化物歧化酶或者上述复合材料或者上述制备方法制得的复合材料在改善氧化应激的药物中的应用。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提出的超氧化物歧化酶耐热性能优异。

技术特征：

1.一种超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。

2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.一种含有权利要求2所述编码基因的表达载体、转基因细胞系或者宿主菌。

4.一种权利要求1-2任一项所述的超氧化物歧化酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.一种复合材料，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的超氧化物歧化酶和金属有机框架。

6.一种权利要求5所述的复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的复合材料的制备方法，其特征在于，在步骤t2中，混合后还包括将混合后的溶液静置，之后离心得到所述复合材料。

8.根据权利要求7所述的复合材料的制备方法，其特征在于，在步骤t2中，所述静置的时间为12h以上。

9.根据权利要求6所述的复合材料的制备方法，其特征在于，在步骤t2中，所述2-甲基咪唑溶液的浓度为15-16mg/ml，所述醋酸锌溶液的浓度为8-9mg/ml，所述htsod溶液的浓度为1-1.2mg/ml；所述2-甲基咪唑溶液或者所述的醋酸锌溶液的添加量为所述htsod溶液的2-2.2倍，所述甲醇溶液的添加量为所述htsod溶液的0.2-0.3倍。

10.一种权利要求1-2任一项所述的超氧化物歧化酶或者权利要求4所述的纯化方法纯化得到的超氧化物歧化酶或者权利要求5所述的复合材料或者权利要求6-9任一项所述的制备方法制得的复合材料在改善氧化应激的药物中的应用。

技术总结
本发明公开一种超氧化物歧化酶、复合材料及其纯化方法、制备方法和应用，属于生物技术领域。该超氧化物歧化酶，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提出一种复合材料，包括上述超氧化物歧化酶和金属有机框架。该复合材料的制备方法，包括以下步骤：T1、将超氧化物歧化酶与水混合得到HtSOD溶液；T2、在超声条件下将所述HtSOD溶液、2‑甲基咪唑溶液、醋酸锌溶液以及甲醇溶液依次混合得到所述复合材料。本发明提出的超氧化物歧化酶耐热性能优异。

技术研发人员：黎育颖,陈卫华,侯振平,石鹏君,林谦,郑霞,王满生,陈青
受保护的技术使用者：中国农业科学院麻类研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15