一种生产丹参素的方法

本发明属于分子生物学和植物基因工程，具体为一种通过农杆菌介导建立转基因丹参毛状根生产丹参素的方法。

背景技术：

1、丹参素分子式为c9h10o5，化学名称为d-(+)-β(3,4-二羟基苯基)乳酸，为酚类芳香酸化合物，含有邻苯二酚结构。丹参素具有广泛的药理学作用，包括心血管系统作用、神经系统作用、抗炎作用和抗肿瘤作用。但因为丹参素是酚酸类成分生物合成途径的中间产物，因此在丹参中的积累水平较低。

2、目前丹参素主要从中药材丹参中提取，但无论是传统水醇法、酶提法，还是微波萃取法，都存在丹参素酚性成分损失较大，含量不稳定等难题，而现有化学全合成丹参素方法，步骤复杂，选择性差，产率低，且环境污染严重。

3、采用生物学方法合成丹参素成为了主要方向，若能提高生物体中丹参素的积累水平，对丹参素的生产具有十分重要的意义。

4、细胞色素p450酶(cytochrome p450s,cyp450)分为p450单氧化酶(cytochromep450 monooxygenases，cyp)以及细胞色素p450还原酶(cytochrome p450 red，cpr)。cyp98a是细胞色素p450家族98a亚家族酶，参与植物绿原酸及迷迭香酸合成过程，目前已经从拟南芥、芸香、彩叶草和红三叶草等都克隆出cyp98a基因。一般认为该基因可能与迷迭香酸的合成有关。

5、cn115216479 a公开了一种重组基因工程菌，以大肠菌e.colibl21(de3)为宿主菌构建双酶共表达大肠杆菌体系，同时表达经过改造的cyp98a75基因和p450还原酶基因cpr，可将底物4-羟基苯乳酸转化为丹参素。

6、该方案需要使用特定底物，还无法提高植物体内丹参素含量，不能实现从丹参中获取丹参素。

技术实现思路

1、本发明旨在提供丹参cyp98a75基因的应用。

2、本发明还提供了一种利用丹参毛状根生成丹参素的方法。

3、本发明技术方案为：

4、细胞色素p450酶或者丹参cyp98a75基因在提高丹参毛状根中的丹参素含量方面的应用。

5、所述的细胞色素p450酶为seq id no.1所示的蛋白或者其同源蛋白。

6、所述丹参cyp98a75基因编码如seq id no.1所示的蛋白或者其同源蛋白。优选的，丹参cyp98a75基因含有如seq id no.2所示的核苷酸序列：(genbank:kp337735.1)。

7、seq id no.1:maplallllslpvffllhnlyyrlrfrlppgprpwpiv gnlydvkplqfrcfadwahsygpiisvwfgstlnvvvsstelakevlkekdqqladryrsrtatrltkygqdliwadygphyvkvrkvctvalfsaksleslrpiredevsamvesiyndctapgnsskslllrkylgavsfnnitriafgkryvdtegrihkqgeemrsiadnrlrlgasraiaehipwlrwmfplneeefakhaarrdrltreimedhniarqksggakqhfcdalltlkekhdltddtiigllwdmihagmdttaisvewamaelirnprvlqkvqeeldrvignervmteldfanlpylrcvakeslrlhpptplmlphrastnvkiggydipkgstvhvnvwavardpevwknplefrperfleddvdikghdfrllpfgagrricpgaqlgldmvtsmlgrllhhfkwappsgvspeainiaerpgvvtfmgtpleavatprlpanlyervavdi

8、seq id no.2:atggcgcctctcgctctcctcctcctctccctccctgtcttcttcctcctccacaacc tctactaccgcctccgcttccgcctccccccgggcccccgcccctggccgatcgtcggcaacctctacgacgtcaagccgctccagttccgctgcttcgccgattgggcccactcctacggccccatcatatccgtctggttcggctccaccctcaacgtcgtcgtttccagcaccgagctcgccaaggaggttctcaaggagaaggatcagcagctcgccgaccgctaccgcagccgcaccgccaccaggctcaccaagtacggtcaggacctgatttgggccgactatggccctcactacgtcaaggtgcggaaggtctgcaccgtcgcgctcttctccgccaagagcctcgaatcgttgaggccaattagagaggatgaggtctccgccatggtcgagtccatctacaatgactgcaccgcccctggcaactcgagtaagagcctgctgctaaggaaatatctaggagcagtgtcattcaacaacattacaagaatt gcattcgggaagagatatgtggatactgaagggagaatacacaagcaaggagaggagatgaggtccattgctgacaacaggttaaggctcggtgcctcccgtgccattgctgagcacattccatggctccgatggatgtttccactgaacgaagaggagtttgctaaacatgcagctcgcagggaccgtctcacacgagaaattatggaagaccacaacatcgcccgccagaagagtggaggagccaagcagcacttctgtgatgcattgctgacactaaaagagaaacatgatctaactgatgacaccatcattggccttctttgggacatgatccatgctggaatggacaccactgcgatatctgtggaatgggccatggcagagctgatcaggaacccaagggtgctacagaaggttcaagaggagctcgaccgtgtcattgggaacgaacgtgtgatgacagaacttgactttgcaaatcttccctacctacggtgtgtggccaaggaatcactcagattgcaccctccgaccccgctcatgcttcctcaccgtgccagtaccaatgtgaagatcggaggctacgacatccccaagggctcaaccgtgcatgtcaacgtgtgggcagttgcacgtgatcccgaggtgtggaaaaatcccctggagtttcgcccggagaggttccttgaggacgacgttgatataaaaggacatgattttaggcttctaccgttcggtgctggaagaagaatatgcccgggggcgcaactcggcctcgacatggtgacgtccatgcttggtcgccttctacaccacttcaaatgggctcctccaagcggggtgagcccagaagccatcaacattgcagagagacccggtgtcgtcaccttcatgggcactccattggaggcagttgctactcccagattaccggcaaacttgtacgagcgtgtcgccgtcgacatttga

9、丹参cyp98a75基因的过表达载体可用于提高丹参毛状根中的丹参素含量。优选的，所述的过表达载体为phb-flag质粒。

10、含有丹参cyp98a75基因的过表达载体的农杆菌可用于提高丹参毛状根中的丹参素含量。优选的，所述的农杆菌为农杆菌c58c1。

11、本发明的另一个技术方案为，一种构建生产丹参素的丹参毛状根的方法，步骤包括：将丹参cyp98a75基因的过表达载体转化农杆菌，用得到的重组农杆菌诱导丹参外植体，获得丹参毛状根。

12、优选的，所述的丹参外植体为叶盘。

13、优选的，将叶盘在重组农杆菌菌液中，20-30℃下浸染5-30min，优选为8-15min。

14、丹参cyp98a75基因的过表达载体通过以下方法制备：

15、(1)扩增丹参cyp98a75基因，并使用bamh i和spe i对过表达载体和扩增片段进行双酶切；

16、(2)经过酶切的过表达载体和丹参cyp98a75基因扩增片段的酶切产物连接，得到丹参cyp98a75基因的过表达载体。

17、所述的过表达载体为phb-flag质粒，扩增引物序列如下：

18、phb-flag-smcyp98a75-f：accagtctctctctcaagcttatggcgcctctcgctctc；

19、phb-flag-smcyp98a75-r：tttaaatcgataccggagctcaatgtcgacggcgaca。

20、连接产物转入感受态工程菌，取阳性菌落培养扩大，并抽提丹参cyp98a75基因的过表达载体。所述的工程菌优选为大肠杆菌。

21、转化农杆菌的方法为：丹参cyp98a75基因的过表达载体导入农杆菌中，获得重组农杆菌。优选的，通过冻融法将丹参cyp98a75基因的过表达载体导入农杆菌中。用利福平(rif)和卡那霉素(kan)筛选重组农杆菌。

22、优选的，所述的农杆菌为农杆菌c58c1。

23、通过以下方法筛选丹参毛状根：

24、浸染后的叶盘在含有0.5mg/l-0.8mg/l cef(头孢噻肟钠)的培养基中培养至出现毛状根；待毛状根长度为3-5cm时，取下接种到并含有cef和hyg(潮霉素)的培养基中继续培养。优选的，所述培养基为1/2ms。

25、在毛状根生长的过程中，对使用的培养基进行梯度降抗处理，更换培养基时，将cef的含量从0.5mg/l-0.8mg/l减至0；同时，在培养基中梯度增加hyg的浓度，hyg的含量从0增至1-3μg/l。

26、抗生素调节后的丹参毛状根，在含有1-3μg/lhyg的培养基中扩大培养，培养周期为30-60天，优选为40-50天。

27、一种生产丹参素的方法，其步骤包括，从上述方法所获得丹参毛状根中提取丹参素。

28、本发明的有益效果在于，将丹参cyp98a75基因用于提高丹参毛状根中丹参素含量，通过构建丹参cyp98a75过表达的重组载体，并在此基础上构建重组农杆菌，基于上述材料，以丹参叶盘作为外植体，通过农杆菌介导，获得能够过表达丹参cyp98a75酶的丹参毛状根，可以提高其中丹参素含量。

29、转化的丹参毛状根中，cyp98a75基因表达水平为野生型毛状根的2-3.8倍，丹参素含量可以达到野生型的4.88倍，显著提高了丹参中的丹参素积累水平，对于丹参素的生产具有十分重要的意义。

30、本发明可获得具有更高丹参素产量的丹参毛状根，毛状根生长迅速，易于培养，无需加入外源底物，就能够提高其中丹参素产量，同时丹参其他组分还可以提取利用，具有广泛的应用前景。