一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法

本发明涉及微生物代谢工程、发酵工程和合成生物学，具体涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组盐单胞菌及其制备方法。

背景技术：

1、聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，pha）是一类可由多种细菌合成的环境友好型生物聚酯，是极具潜力的石油基替代产品之一。同时，pha在医用植入材料、可降解包装材料、食品级涂层材料和动物饲料等领域也有着广泛的应用前景。传统的发酵工艺存在灭菌过程需要大量消耗能源，大量消耗淡水，容易染菌等不足，严重制约了现代工业生物技术的快速发展。为解决上述不足，基于极端嗜盐微生物底盘菌开发的下一代工业生物技术（next generation industrial biotechnology，ngib）体系无需灭菌可直接进行开放式、连续发酵，工程化流程较为简单，能显著提高发酵过程的稳定性。盐单胞菌 halomonas  bluephagenesis是清华大学陈国强课题组在新疆艾丁湖分离出的一株嗜盐菌，具有广泛的环境适应性和耐盐、耐碱等特性，是ngib工艺的重要底盘菌株之一。野生型 halomonas  bluephagenesis在无灭菌条件下以葡萄糖为唯一碳源能积累超过细胞干重80%的p3hb（聚3-羟基丁酸酯）。

2、pha聚合物按照单体的组成可分为均聚pha和共聚pha。均聚pha由一种单体组成，材料学性能较单一。共聚pha由两种及以上的单体组成，可通过改变其单体摩尔比来调控材料学性能从而满足不同的应用需求。聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯即poly(3-hydroxybutyrate- co-3-hydroxyvalerate)，简称p(3hb- co-3hv)或p3hb3hv，是一种由短链单体（c4）和中链单体（c5）聚合而成的共聚pha，可通过调节3hv单体的比例来调控其材料学性能，具有广阔的应用前景和巨大的市场需求。

3、目前，cn101845414b公开了使用恶臭假单胞菌生产pha，但是对于带有3hv单体的pha只涉及均聚物，并不涉及包含3hv与其他单体的均聚。

4、专利cn114134096b公开了重组盐单胞菌 halomonas bluephagenesis能以葡萄糖作为唯一碳源来生产p3hb3hv，或以葡萄糖和丙酸作为混合碳源来生产p3hb3hv并进一步通过调节丙酸的添加量来调控3hv单体的摩尔比。但是获得的p3hb3hv材料中的3hv单体摩尔比低，3hv单体可调节范围比较窄，材料学性能相对有限。

5、因此，面对生物基可降解材料日益增加的市场需求和多元化的应用场景，基于盐单胞菌底盘菌株和ngib工艺开发3hv单体比例可调、可持续和高效益生产p3hb3hv的方法，对进一步降低生产成本，拓宽p3hb3hv的材料学性能，具有十分重要的促进作用。

技术实现思路

1、基于目前现有技术中生产包含3hv单体的pha，都需要在出发菌株中导入合成3hv相关的基因进行改造后，进行生产，对于3hv摩尔量的调控范围也受限等的问题。本技术提供了野生型盐单胞菌以及经过改造的盐单胞菌都适用的包含3hv单体的pha的生产方法。该方法3hv的可调范围大，通过基因改造也可以上调3hv的摩尔量。具体的，利用特定碳源以及不同碳源之间的比例对盐单胞菌的培养进行调节，再结合基因编辑对盐单胞菌进行改造，可以获得3hv摩尔比在0-98%的范围内调整的pha，以此调控包含3hv单体的pha的材料性能。另外，也证实了通过弱化盐单胞菌内源β氧化循环途径的关键基因（例如 fadb）可以显著上调pha中3hv单体的摩尔比。具体方案如下：

2、本发明的第一方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法或调节盐单胞菌生产聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体摩尔比的方法，所述的方法包括以底物培养盐单胞菌，所述的底物包括戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上。

3、所述的底物还包括常规碳源，例如葡萄糖、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯、蔗糖、果糖、有机酸或有机酸盐中的一种或两种以上。所述的有机酸或有机酸盐例如乙酸、丙酸、丙酸盐、丁酸、丁酸盐、己酸、己酸盐或中长链脂肪酸（例如十二酸、棕榈油或油酸）中的一种或两种以上。

4、所述的盐可以为钾盐、钙盐、钠盐、镁盐、铝盐、锌盐或铁盐等。例如所述的戊酸盐可以为戊酸钾、戊酸钙、戊酸钠、戊酸镁、戊酸铝、戊酸锌或戊酸铁等。例如所述的庚酸盐可以为庚酸钾、庚酸钙、庚酸钠、庚酸镁、庚酸铝、庚酸锌或庚酸铁等。

5、所述的底物包含在培养基中。

6、所述的培养基可以为固体培养基、液体培养基或半固体培养基。

7、当所述的培养基为液体培养基时，所述的底物浓度为0.0001-100g/l中的任一数值，优选1-50g/l中的任一数值，例如0.0001、0.1、1、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、20、30、40、50g/l等。

8、所述的戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上在培养基中的浓度为0.0001-10g/l中的任一数值，优选1-7g/l中的任一数值，例如0.0001、0.1、1、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10g/l等。

9、在本发明的一个具体实施方式中，所述的底物包括：

10、组分a：戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上；

11、组分b：葡萄糖；

12、其中，组分a与组分b的质量比（0.0001-7）：（0-30），例如（0.0001、1、2、3、4、5、6、7）：（0、5、10、15、20、25、30），优选7：（0-30），例如7：（0、5、10、15、20、25、30）。

13、所述的培养基中还包括氮源、无机盐以及微量元素、生长因子和其他有利于菌体生长和代谢的物质。

14、所述的氮源可以为无机氮源和/或有机氮源。所述的无机氮源例如硝酸盐、铵盐、亚硝酸盐或氨水等中的一种或两种以上。所述的有机氮源例如花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、酵母提取物、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨、胰蛋白胨、麸皮或废菌丝体等中的一种或两种以上。

15、所述的无机盐用于维持所述盐单胞菌所需的渗透压。例如钾盐和/或钠盐等。所述钾盐包括但不限于氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钾、乙酸钾、葡萄糖酸钾、硝酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾或磷酸二氢钾中的一种或两种以上。所述的钠盐包括但不限于氯化钠、硫酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、葡萄糖酸钠、硝酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸二氢中的一种或两种以上。

16、在本发明的一个具体实施方式中，通过调整底物类型或含量或不同底物之间的比例可以调节菌体的生长、聚羟基脂肪酸酯的产量以及聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸的摩尔比。例如调整组分a与组分b的比例来调节pha中3hv单体的摩尔比。

17、所述的聚羟基脂肪酸酯为由单体组成的均聚物或共聚物，所述的单体包括3-羟基戊酸。

18、在本发明的一个具体实施方式中，所述的聚羟基脂肪酸酯（pha）包括但不限于phv、p3hb3hv、p3hb4hb3hv或p3hb3hv3hhx中的一种或两种以上。

19、所述的聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体的摩尔比为0-98%中的任一数值，优选5-98%或60-98%中的任一数值。例如0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%等。

20、所述的盐单胞菌表达烯酰辅酶a水合酶（phaj）。优选的，所述的phaj可以为内源的或外源的。

21、优选的，所述的烯酰辅酶a水合酶来源于 aeromonas caviae（优选aeromonascaviae fa440）和/或 aeromonas hydriphila（优选 aeromonas hydriphila 4ak4）。

22、其中，来源于 aeromonas caviae fa440的phaj的氨基酸序列包含seq id no：1或其变体。

23、进一步的，所述的盐单胞菌过表达烯酰辅酶a水合酶，所述的过表达包括提高烯酰辅酶a水合酶/基因（ phaj）的启动子强度和/或向盐单胞菌中导入烯酰辅酶a水合酶基因。例如在内源本底表达的基础上进一步导入 phaj实现过表达。又例如用比内源表达更强或活性更强的 phaj替换内源 phaj，即使内源 phaj失活后进行导入。

24、所述的导入的烯酰辅酶a水合酶编码基因在质粒上表达或在染色体上表达。

25、所述的导入采用表达载体导入，所述的表达载体包含phaj编码基因。

26、所述的phaj编码基因由诱导型启动子和/或组成型启动子调控，也可以由将组成型启动子改造为具有诱导特性的启动子进行调控。

27、所述的诱导型启动子包括但不限于 plux启动子、 plac启动子、 phap启动子或 fadba启动子中的一种或两种以上。

28、所述的 plux启动子为ahl（高丝氨酸内酯）型诱导型启动子。优选的，所述的ahl诱导浓度为0-2mm，优选为0.0001-0.01mm中任一数值，例如0、0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2mm。优选的， plux启动子的核苷酸序列包含seq id no：5或其变体。

29、所述的 plac启动子（seq id no：6）为iptg（异丙基-β-d-硫代半乳糖苷）型诱导型启动子。优选的，所述的iptg诱导浓度为0-5g/l，优选为0.02-2g/l中任一数值，例如0、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5g/l。

30、 plac启动子（seq id no：6）：ccgcttctagagctcggtaccaaattccagaaaagaggccgcgaaagcggccttttttcgttttggtcctactagatgcctccacaccgctcgtcacatcctgcccatgagttaattatatttgtggcattatagggagaattgtgagcgctcacaatt

31、所述的组成型启动子包括但不限于野生型 pporin（seq id no：7）或其突变体。优选的，所述的 pporin突变体包括但不限于突变型 pporin58（seq id no：8）、突变型 pporin42（seq idno：9）、突变型 pporin68（seq id no：10）、突变型 pporin140、突变型 pporin278（seq id no：11）、突变型 pporin194（seq id no：12）、突变型 pporin211、突变型 pporin221（seq id no：13）、突变型 pporin203（seq id no：14）。

32、野生型 pporin（seq id no：7）：ttgcgttcactggaatcccannntagagtttgacctgcgagca；

33、 pporin42（seq id no：9）：ttgcgttcactggaatcccactatagagtttgacctgcgagca；

34、 pporin278（seq id no：11）：ttgcgttcactggaatcccagtattaaatttgacctgcgagca；

35、 pporin194（seq id no：12）：ttgcgttcactggaatcccagtatctaatttgacctgcgagca；

36、 pporin221（seq id no：13）：ttgcgttcactggaatcccagtatgctatttgacctgcgagca；

37、 pporin203（seq id no：14）：ttgcgttcactggaatcccagtatcccttttgacctgcgagca。

38、所述的 phap启动子具有pha颗粒调控蛋白（phar）的结合位点，以产生的pha为诱导剂进行调控表达。当然也可以将现有技术中的组成型启动子改造为包含phar结合位点且具有启动子活性，以产生的pha为诱导剂进行调控表达（可参考专利申请2021116569347中的技术）。

39、所述的 fadba启动子具有响应油酸的蛋白质的结合位点，以油酸为诱导剂进行调控表达。当然也可以将现有技术中的组成型启动子改造为包含可以响应油酸的蛋白质的结合位点且具有启动子活性，以油酸为诱导剂进行调控表达（可参考专利申请2022103805971中的技术）。

40、导入的烯酰辅酶a水合酶来源于 aeromonas caviae（优选 aeromonas caviae fa440）和/或 aeromonas hydriphila（优选 aeromonas hydriphila 4ak4）中的一种或两种以上。

41、所述的盐单胞菌还表达或过表达pha水合酶（phac）。优选的，所述的phac可以为内源的或外源的。

42、优选的，所述的phac来源于 halomonas bluephagenesis（优选 halomonas  bluephagenesis td01） 、aeromonas caviae（优选 aeromonas caviae fa440）或 aeromonas  hydriphila（优选 aeromonas hydriphila 4ak4）中的一种或两种以上。

43、其中，来源于 aeromonas caviae fa440的phac的氨基酸序列包含seq id no：18。

44、所述的过表达包括提高内源phac编码基因的启动子强度和/或向盐单胞菌中导入phac编码基因和/或将内源phac替换为酶活性更好的phac，例如替换为 aeromonas caviae（优选 aeromonas caviae fa440）来源的phac。

45、所述的导入的phac编码基因在质粒上表达或在染色体上表达。

46、所述的phac编码基因由诱导型启动子和/或组成型启动子调控，也可以由将组成型启动子改造为具有诱导特性的启动子进行调控。

47、所述的方法包括弱化盐单胞菌内源β氧化循环途径的关键基因，例如 fada、 fadb、 fadd、 fade或 fadl等。优选的，所述的方法包括盐单胞菌内源β氧化循环途径的关键基因失活。

48、所述的失活包括：敲除或敲低β氧化循环途径的关键基因的全部或部分，和/或，突变β氧化循环途径的关键基因，使得该基因无法正常表达蛋白或表达的蛋白活性减弱或无活性。

49、优选的，所述的盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱。

50、所述的脂肪酸氧化复合物亚基α为fadb（包含seq id no：3）。

51、所述的方法包括敲除或敲低脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因（ fadb）。优选的敲除 fadb的全部或部分碱基，或者通过突变使得该基因无法正常表达蛋白，或者，表达的蛋白活性减弱或无活性。

52、所述的方法包括使用靶向 fadb的sgrna进行敲除或敲低，所述的sgrna包含seq idno：15或2。

53、在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱，所述的盐单胞菌不表达内源pha水合酶，以及，所述的盐单胞菌表达来源于 halomonas bluephagenesis、aeromonas  caviae或 aeromonas hydriphila的pha水合酶，和表达来源于 aeromonas caviae或 aeromonas hydriphila的烯酰辅酶a水合酶。

54、优选的，所述的盐单胞菌表达4-羟基丁酰辅酶a转移酶。

55、优选的，所述的盐单胞菌不表达月桂酰酰基转移酶和/或脂质a生物合成肉豆蔻酰基转移酶，或表达的月桂酰酰基转移酶和/或脂质a生物合成肉豆蔻酰基转移酶不具有功能。

56、优选的，所述的盐单胞菌不表达pha颗粒结构蛋白1，或表达的pha颗粒结构蛋白1不具有功能。

57、所述的盐单胞菌的基因组中包含 phacab。

58、在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌为将4hb-coa转移酶编码基因整合进基因组，敲除或敲低 phap1基因，敲除或敲低 lpxl基因，敲除或敲低 lpxm基因，将表达 phacab的pmmp1启动子替换为pporin启动子，再过表达与必需基因 ompw相关联的额外的 phacab。

59、所述的盐单胞菌为盐单胞菌属，例如包括 halomonas bluephagenesis或其衍生菌 、halomonas campaniensis或其衍生菌或 halomonas aydingkolgenesis或其衍生菌。

60、在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌为halomonas bluephagenesiswzy278，该菌具有外膜缺陷，利于下游提取等特点，但是并不适用于生产3hv，本技术通过调节底物，将该菌用于生产3hv，且3hv的摩尔量可调。

61、所述培养的条件可以根据具体盐单胞菌适当调整。

62、所述的培养包括种子培养、摇瓶培养或发酵罐培养。

63、所述培养的温度为30-40℃。

64、所述培养过程无需灭菌。

65、本发明的第二方面，提供了一种上述的方法获得的聚羟基脂肪酸酯。

66、本发明的第三方面，提供了一种上述方法制备的聚羟基脂肪酸酯在制备生物可降解材料中的应用。例如医用植入材料、可降解包装材料、食品级涂层材料和动物饲料等。

67、本发明的第四方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组盐单胞菌，所述的重组盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱。

68、所述的脂肪酸氧化复合物亚基α为fadb。

69、所述的重组盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能通过敲除或敲低脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因实现。

70、优选的，使用靶向脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因的sgrna进行敲除或敲低，所述的sgrna包含seq id no：15或2。

71、所述的重组盐单胞菌表达或过表达烯酰辅酶a水合酶。所述的烯酰辅酶a水合酶来源于 aeromonas caviae（优选 aeromonas caviae fa440）和/或 aeromonas hydriphila（优选 aeromonas hydriphila 4ak4）。

72、所述的盐单胞菌还表达或过表达pha水合酶（phac）。优选的，所述的phac可以为内源的或外源的。

73、优选的，所述的phac来源于 halomonas bluephagenesis（优选halomonasbluephagenesis td01） 、aeromonas caviae（优选aeromonas caviae fa440）或 aeromonas  hydriphila（优选aeromonas hydriphila 4ak4）中的一种或两种以上。

74、所述的聚羟基脂肪酸酯为由单体组成的均聚物或共聚物。所述的单体包括3-羟基戊酸。

75、所述的重组盐单胞菌包括 halomonas bluephagenesis、halomonas campaniensis或 halomonas aydingkolgenesis。

76、所述的重组盐单胞菌以包含戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上为底物，生产包含3-羟基戊酸单体的聚羟基脂肪酸酯。

77、本发明的第五方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组盐单胞菌，所述的重组盐单胞菌过表达烯酰辅酶a水合酶。

78、优选的，所述的烯酰辅酶a水合酶来源于 aeromonas caviae（优选 aeromonas  caviae fa440）和/或 aeromonas hydriphila（优选 aeromonas hydriphila 4ak4）。

79、优选的，所述的重组盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱。

80、本发明的第六方面，提供了一种重组盐单胞菌，所述的重组盐单胞菌不表达月桂酰酰基转移酶和/或脂质a生物合成肉豆蔻酰基转移酶，或表达的月桂酰酰基转移酶和/或脂质a生物合成肉豆蔻酰基转移酶不具有功能。

81、优选的，所述的盐单胞菌不表达pha颗粒结构蛋白1，或表达的pha颗粒结构蛋白1不具有功能。

82、优选的，所述的盐单胞菌表达4-羟基丁酰辅酶a转移酶。

83、所述的盐单胞菌的基因组中包含 phacab。

84、所述的盐单胞菌的基因组中包含 phacab。

85、在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌为将4hb-coa转移酶编码基因整合进基因组，敲除或敲低 phap1基因，敲除或敲低 lpxl基因，敲除或敲低 lpxm基因，将表达 phacab的pmmp1启动子替换为pporin启动子，再过表达与必需基因 ompw相关联的额外的 phacab。

86、本发明的第七方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组盐单胞菌的制备方法，所述的重组盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱。

87、所述的重组盐单胞菌表达烯酰辅酶a水合酶。

88、所述的聚羟基脂肪酸酯为由单体组成的均聚物或共聚物，所述的单体包括3-羟基戊酸。

89、所述的制备方法包括使用靶向脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因的sgrna进行敲除或敲低，所述的sgrna包含seq id no：15或2。

90、所述的制备方法包括：

91、1）敲除盐单胞菌的 fadb基因，优选的，使用crispr/cas9基因组编辑方法来敲除 fadb基因；优选的，所述的crispr/cas9基因组编辑方法包括使用sgrna，优选所述的sgrna的核苷酸序列包含如seq id no：15或2所示核苷酸序列。

92、2）将1）获得的 fadb基因失活质粒结合转化至盐单胞菌中。

93、所述的制备方法包括提高烯酰辅酶a水合酶编码基因的启动子强度和/或向重组盐单胞菌中导入异源的烯酰辅酶a水合酶编码基因。

94、导入的烯酰辅酶a水合酶编码基因在质粒上表达或在染色体上表达。

95、所述的烯酰辅酶a水合酶编码基因由诱导型启动子和/或组成型启动子调控。

96、在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括将下列任一种或两种以上的质粒导入盐单胞菌中：

97、a） phajfa440基因表达质粒；

98、b） fadb基因失活质粒。优选sgrna、上下游同源臂，和/或，cas9蛋白的编码基因，进一步优选的，所述的sgrna靶向 fadb基因，所述的上下游同源臂来源于 fadb基因。

99、本发明的第八方面，提供了一种上述制备方法获得的重组盐单胞菌。

100、本发明的第九方面，提供了一种载体，所述的载体为 phajfa440基因表达质粒、 fadb基因失活质粒或 phac- phaj功能模块整合质粒中的一种或两种以上。

101、所述的 phajfa440基因表达质粒包含 phajfa440基因，优选还包括调控元件。

102、 phac- phaj功能模块整合质粒包含 phac基因和 phaj基因，以及上下游同源臂。优选的，所述的 phac- phaj功能模块整合质粒的序列包含seq id no：4或其变体。

103、优选的，所述的载体上还包含启动子，例如诱导型启动子和/或组成型启动子，也可以为将组成型启动子改造为具有诱导特性的启动子。

104、优选的，所述的载体还包括中还包含核糖体结合位点和终止子。进一步优选的，所述的核糖体结合位点，和/或，终止子可以是现有技术中任一核糖体结合位点，和/或，终止子序列。

105、本发明的第十方面，提供了包含上述载体的细胞。

106、本发明的第十一方面，提供了上述的载体、细胞、盐单胞菌或重组盐单胞菌在生产pha（特别是p3hb3hv）中的应用。

107、本发明的第十二方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，所述的方法包括培养上述的重组盐单胞菌，和/或，上述的制备方法获得的重组盐单胞菌。

108、本发明的第十三方面，提供了一种发酵方法，所述的发酵方法包括发酵培养上述的重组盐单胞菌，和/或，上述的制备方法获得的重组盐单胞菌。

109、优选的，所述的发酵培养使用的培养基为现有技术已知的培养基或者为了适应微生物的生存和产生产物适当的调整培养基的成分。也可以采用上述所述的包含戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐一种或两种以上为底物。

110、本发明的第十四方面，提供了一种发酵方法，所述的发酵方法包括以戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐一种或两种以上为底物培养盐单胞菌生产包含3hv单体的pha。

111、优选的，所述的发酵方法无需灭菌。

112、优选的，所述的发酵产物优选为p3hb3hv。

113、所述发酵的条件可以根据具体重组盐单胞菌适当调整。

114、所述发酵的设备可以为摇瓶、小试发酵罐、中试发酵罐或者工业大量生产的大型发酵罐。

115、本发明的第十五方面，提供了一种调节盐单胞菌生产聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体摩尔比的方法，所述的方法包括培养上述的重组盐单胞菌，和/或，上述的制备方法获得的重组盐单胞菌。

116、所述的培养过程中碳源包括戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐一种或两种以上。优选的，所述的碳源还包括葡萄糖。

117、在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源包括：

118、组分a：戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上；

119、组分b：葡萄糖；

120、其中，组分a与组分b的质量比（0.0001-7）：（0-30）。

121、本发明的第十六方面，提供了一种用盐单胞菌催化底物生产3-羟基戊酸或包含3-羟基戊酸单体的pha的方法，所述的方法培养盐单胞菌，所述的底物包括戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上。

122、本发明的第十七方面，提供了一种培养盐单胞菌生产包含3hv单体的pha的培养基，所述的培养基中包含碳源，所述的碳源包含戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上。优选还包含葡萄糖。

123、所述的盐单胞菌可以为野生型或改造型，所述的改造型优选为上述的重组盐单胞菌。

124、本发明所述的“β氧化循环途径”是指将脂肪酸分解为较短的脂肪酸和乙酰辅酶a以及乙酰辅酶a与脂肪酸合成长的脂肪酸的过程。包括脂肪酸的激活，即将脂肪酸与辅酶a结合形成酰辅酶a；脂肪酸的转运，即将酰辅酶a转运到线粒体内；脂肪酸的氧化，即将酰辅酶a分解为较短的脂肪酸和乙酰辅酶a；脂肪酸的合成，即将乙酰辅酶a与其他脂肪酸合成更长的脂肪酸。所述的“β氧化循环途径的关键基因”包括所有在β氧化循环途径中涉及的酶的编码基因以及调控这些酶的活性或表达的基因，所述的酶例如激活所需的酶、转运所需的酶、氧化所需的酶、合成所需的酶。

125、本发明所述的“过表达”为将基因上调表达，高于原本天然的表达量或使得原本不表达变为表达。其中，所述的“上调表达”可以为通过强化调控元件，上调基因的表达，也可以通过进一步导入一定拷贝数的编码序列等等。

126、本发明所述的“变体”可以为经过取代、缺失、突变、插入等方式获得的同源性在一定范围的序列，且该序列依然保留原始的活性或高于原始的活性或具备了其他的优势等等，所述的同源性范围优选为60-100%中的任一数值，例如60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99.1%、99.5%、99.9%、100%等。

127、本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含所有描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤；当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

128、本发明术语“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

129、本技术英文简写与中文全称对照见表1。

130、表1：英文简写与中文全称对照

131、

132、以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

133、本技术提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。