镰孢菌RPA-CRISPR/Cas检测试剂盒和方法与流程

本发明涉及分子检测，具体涉及一种镰孢菌rpa-crispr/cas检测试剂盒和方法。

背景技术：

1、玉米是世界上第一大作物，也是我国最重要的粮食作物之一。玉米茎腐病作为严重威胁我国玉米生产的土传病害，已在我国20多个玉米生产省区相继发生报道，一般年份发病率为15%~20%，严重时可达70%以上，由此病害导致的产量损失在20%左右，严重时可达50%以上，其已成为影响我国区域玉米机械化采收前倒伏和籽粒损失的重要因素，并对国家构建粮食安全体系及保障区域玉米安全生产造成不利影响。

2、国内外大量研究表明，引起玉米茎腐病的病原菌种类比较多，目前已知的有30余种，我国主要分为肿囊腐霉 pythium inflatum和禾谷镰孢 fusarium graminearum两大类，其可由镰孢菌、腐霉菌、炭疽菌单独或复合侵染引起，且不同地区玉米茎腐病的致病菌存在差异。2017年，贺娟等报道禾谷镰孢 f. graminearum和拟轮枝镰孢 f. verticillioides是云南省玉米茎腐病的优势种群；2019年，刘树森等研究黄淮海夏玉米主产区茎腐病，认为河北省以拟轮枝镰孢菌 f. verticillioides检出率最高，山东省以层出镰孢 f.  proliferatum和芒孢腐霉 p. aristosporum为优势种；同年，郭成发现甘肃省四大生态区中禾谷镰孢复合种 f. graminearum speciescomplex和拟轮枝镰孢 f. verticillioides为玉米茎腐病的优势病原菌。2020-2021年，宋子硕在新疆共采集335株玉米茎腐病病样，共得到601个分离物，其中镰孢菌560株，占比93.18%，其中拟轮枝镰孢菌 f. verticillioides、层出镰孢菌 f. proliferatum、禾谷镰孢菌 f. graminearum、尖孢镰刀菌 f. oxysporum、腐皮镰孢菌 f. solani为主要优势致病菌。

3、重组酶聚合酶扩增 (recombinase polymerase amplification，rpa)是piepenburg等人在2006年利用参与细胞dna合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术。与常规pcr需要仪器进行循环扩增不同的是，rpa在37~42℃条件下操作，只需少量的样本制备，即可在10 min内扩增低至1-10个dna拷贝，具有高灵敏度、可选择性、便携性、快速与可以进行多重扩增等优点。目前已经广泛应用于扩增多种不同靶标，包括rna、mirna、ssdna和dsdna。rpa反应利用重组酶与寡核苷酸引物形成蛋白-dna复合物，能够在双链dna中寻找同源序列。一旦定位了同源序列，就会发生链置换反应形成并启动dna合成，对模板上的靶标进行指数式扩增。单链dna结合 (ssb) 蛋白与置换的dna链结合并形成的d环，防止进一步替换。整个扩增反应迅速，从几个目标dna拷贝开始，在几分钟内即可达到可检测的水平。

4、crispr（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr）是一套来源于细菌和古细菌的免疫系统，识别并抵御外源性核酸。研究人员发现cas12和cas13家族具备collateral cleavage能力（或称为cleavagein trans），即cas蛋白-crrna二元复合体识别并结合底物后，不仅能切割底物，还能切割游离在环境内的任意底物。基于重组酶聚合酶扩增（rpa）技术结合成簇规律间隔短回文重复序列及crispr相关蛋白系统（crispr associated enzyme systems，cas蛋白）——crispr/cas蛋白的分子检测技术的原理是：底物dna或rna首先经rpa或rt-rpa(reverse transcription rpa)扩增，提高底物浓度；随后，转录酶将扩增后的dna转录为rna，并与rna内切核酸酶、crrna反应液混合。当cas蛋白-crrna复合体识别底物rna后，发生顺式切割和反式切割，最后根据实验需求选择合适的检测方法，如电泳、实时荧光、比色法等进行检测分析。

5、关于镰孢菌的检测已有采用rpa检测的报道，但其检测的特异性和灵敏度有限。目前鲜有采用rpa联合crispr/cas检测镰孢菌的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是针对上述问题，提供一种镰孢菌rpa-crispr/cas检测试剂盒，cas蛋白为cas12，所述试剂盒包括rpa引物和crrna，所述镰孢菌包括层出镰孢菌，层出镰孢菌的rpa引物和crrna分别为引物组合fprof2/fpror3、fp-crrna2，序列如下：

2、fprof2: 5’-cgcgtcctctgcccaccgatttcacttg-3’，

3、fpror3: 5’-agcggcttcctattgtcgaatggttagtcg-3’，

4、fp-crrna2: uaauuucuacuaaguguagaugucucgagcgggguagcaggc。

5、优选地，所述镰孢菌还包括拟轮枝镰孢菌和/或禾谷镰孢菌，

6、所述拟轮枝镰孢菌的rpa引物和crrna分别为引物组合fverf1/fverr1、fv-crrna，序列如下：

7、fverf1：5’-gatttctcaaagaaaacatgctgacatcgc-3’，

8、fverr1：5’-agctcagtgaggttgtggaatgggagagggcag-3’，

9、fv-crrna：uaauuucuacuaaguguagaucccaucgauuccccccuacgac；

10、所述禾谷镰孢菌的rpa引物和crrna分别为引物组合fgraf2/fgrar2、fg-crrna，序列如下：

11、fgraf2: 5’-gggcgctcatcatcacgtgtcaaccagtc-3’，

12、fgrar2: 5’-ccatgttagtatgagaatgtgatgacagcagtg-3’，

13、fg-crrna: uaauuucuacuaaguguagauagcuugucaagaacccaggc。

14、优选地，所述的试剂盒还包括信号报告分子，所述信号报告分子的序列为：5’-ttattatt-3’或5’-tttttttttt-3’；

15、优选所述信号报告分子的5’端标记荧光报告基团，3’端标记生物素亲和基团，或者，所述信号报告分子的两端分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团用于荧光信号检测，优选所述荧光报告基团为fam，所述荧光淬灭基团为bhq1。

16、优选地，所述的试剂盒还包括rpa扩增试剂，所述rpa扩增试剂包含：rpa酶、mgoac。

17、优选地，所述的试剂盒还包括crispr/cas检测试剂，所述crispr/cas检测试剂包含：cas12a蛋白、rnase抑制剂、dtt，

18、所述cas12a蛋白选自ascas12a、lb4cas12a、lb5cas12a、fncas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a和bocas12a，

19、优选所述cas12a蛋白为lbacas12a。

20、本发明的再一目的是提供上述任一项所述的试剂盒在检测镰孢菌中的应用，所述镰孢菌包括层出镰孢菌。

21、本发明的再一目的是提供一种镰孢菌rpa-crispr/cas检测方法，利用上述任一项所述的试剂盒检测，包括如下步骤：

22、s1、提取待测样本的dna；

23、s2、rpa扩增：配制rpa反应体系，通过rpa方法扩增上述提取得到的待测样本的dna，得扩增产物；

24、s3、crispr/cas系统反应检测：取上述扩增产物，加入信号报告分子、cas蛋白和crrna，进行crispr反应检测，读取检测信号，即得。

25、在上述的镰孢菌rpa-crispr/cas检测方法的技术方案中，所述rpa扩增的反应体系包括28.5~30.5 μl 补液缓冲液、10.5~12 μl ddh2o、10 μm的上下游引物各1~3 μl、rpa酶冻干粉、1~3 μl 模板dna、1.5~3.5 μl 浓度为280 μmol/l的mgoac；优选为29.5 μl 补液缓冲液、11.2 μl ddh2o、10 μm的上下游引物各2.4 μl、rpa酶冻干粉、2 μl 模板dna、2.5 μl 浓度为280 μmol/l的mgoac；rpa扩增的反应条件是：37~42℃反应10~30 min；

26、所述crispr/cas系统反应的反应体系包括：nebuffer 1.5~2.5 μl、5 μmlbacas12a 0.8~1.2 μl、40u/μl rnase inhibitor 0.4~0.6 μl、0.1 m dtt 0.4~0.6 μl、10 μm信号报告分子1.5~2.5 μl和10 μm crrna 0.8~1.2 μl；所述crispr/cas系统反应条件是：37~42℃反应5~30 min；

27、所述读取检测信号采用实时定量pcr仪读取荧光信号或者采用crispr/cas试纸条判断结果。

28、本发明的最后一目的是提供另一种检测方法：一种镰孢菌rpa-crispr/cas一步法检测方法，利用前述任一项所述的试剂盒检测，包括如下步骤：

29、提取待测样本的dna作为模板dna；将模板dna和rpa反应体系加入pcr管中，将crispr/cas系统反应体系滴加在pcr管的管盖内部，盖上管盖，将pcr管置于rpa反应温度下进行rpa扩增，之后甩动pcr管或简短离心使管盖内的crispr/cas系统反应体系溶液完全进入pcr管内的rpa扩增产物溶液中，再将pcr管置于crispr/cas系统反应温度下反应，反应完毕读取检测信号，即得。

30、在上述的一步法检测方法的技术方案中，所述rpa扩增的反应体系包括5.7~6.1 μl 补液缓冲液、2.1~2.4 μl ddh2o、10 μm的上下游引物各0.2~0.6 μl、rpa酶冻干粉、0.2~0.6 μl 模板dna、0.3~0.7 μl浓度为280 μmol/l的mgoac；rpa扩增的反应条件是：37~42℃反应10~30 min；

31、所述crispr/cas系统反应的反应体系包括：nebuffer 1.5~2.5 μl、5 μmlbacas12a 0.8~1.2 μl、40u/μl rnase inhibitor 0.4~0.6 μl、0.1 m dtt 0.4~0.6 μl、10 μm信号报告分子1.5~2.5 μl和10 μm crrna 0.8~1.2 μl；所述crispr/cas系统反应条件是：37~42℃反应5~30 min；

32、所述读取检测信号采用实时定量pcr仪读取荧光信号或者采用crispr/cas试纸条判断结果。

33、本发明的有益效果是：

34、本发明针对分布广、分离频率高、致病性强的玉米茎腐病病原菌，开发基于重组酶聚合酶扩增技术结合crispr及crispr相关蛋白系统crispr/cas12a的玉米茎腐病病原菌现场可视化快速检测技术。该技术可在37-42℃恒温条件下进行反应，无需复杂的仪器设备，crispr/cas12a可识别并切割特定核酸序列，从而在rpa基础上进一步增加了检测的特异性和灵敏度。