一种靶向GPRC5D的抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种靶向gprc5d的抗体及其应用，尤其涉及与人gprc5d抗原蛋白和细胞膜表面天然状态的gprc5d抗原特异性结合的抗体。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤（multiple myleloma）是一种发生于骨髓的浆细胞肿瘤。该肿瘤会引发高钙血症、贫血、肾功能障碍、骨坏死和骨髓衰竭等病症。目前多发性骨髓瘤是第二大常见血液肿瘤。全球多发性骨髓瘤的发病率和死亡率比为1.8:1.1，亚洲为1.1:0.76，可见多发性骨髓在发病人群的生存率较低。主要原因一是发生人群的年龄中位值偏高在66岁左右，40岁以下人群的发生率在2%左右。二是多发性骨髓瘤在常用的化疗，免疫调节剂以及单抗疗法下几乎无治愈可能性，勉强缓解也伴随着极高的复发率，即复发难治性骨髓瘤（relapsed/refractory multiple myeloma（rrmm），五年生存率仅有51%。

2、近年来在多发性骨髓瘤治疗上，t细胞双特异性抗体疗法bispecific t cellengagers（bites），和继发性t细胞疗法adoptive t cell therapy（act）取得了突破性进展。针对多发性骨髓瘤的靶向疗法产品靶点主要有bcma、cd38、cd138和gprc5d等。cd38和cd138还会在正常组织的细胞上及造血干细胞上表达，利用靶向疗法清除后副作用较大，往往会对正常器官造成损伤或是自身免疫系统受损，而bcma和gprc5d主要表达在浆细胞或骨髓瘤中的浆细胞上，而浆细胞可以依靠人体自身b细胞的不断再生得到弥补。以t细胞双特异性抗体产品为例，bcma靶点的产品主要有再生元制药公司研发（regeneronpharmaceuticals, inc.（regn））的regn5458，强生研发的teclistama，以及安进的amg420。regn5458目前已结束临床一期实验（nct03761108）。19名接受治疗的患者种，42%达到完全缓解（cr）或者严格完全缓解（scr）；teclistamab已进入临床二期实验（nct04557098），临床一期结果显示，总体响应率（orr）为65%，40%的患者完全缓解（cr）；amg420的临床一期（nct03836053）显示，总体响应率（orr）为71%。

3、百时美施贵宝（bms）研发的针对多发性骨髓瘤bcma靶点的car-t产品－bb2121在2021年5月被fda批准为第一款多发性骨髓瘤上市的car-t产品。该产品总体响应率（orr）为72%，28%患者可达到严格完全缓解（scr）。尽管该产品为多发性骨髓的治愈带来了希望，但是从公布的数据来看，其完全缓解（cr）的患者中22个月疾病无进展生存期占比也不到50%，可见治疗后期也存在较高的复发率。此外，由于该疗法清除所有的浆细胞，仍然有血细胞减少免疫球蛋白降低等引发的副作用。gprc5d表达相对bcma更为特异，仅在骨髓瘤患者的浆细胞中表达，而正常组织几乎不表达，仅在毛囊组织中能检测到明显的rna和蛋白表达。在敲除gprc5d的老鼠与正常野生型的表型比较上（包括体重，器官形态学差异，生殖率等），也未发现明显差异，可见gprc5d缺失对生存和正常器官的代谢并非必需，其清除的副作用较小。进一步发现，bcma的表达和gprc5d并没有相关性，两者虽然都同时在浆细胞中表达，但表达谱相对独立。可见对于bcma car-t疗法后期患者中bcma表达偏低，可用靶向gprc5d来治疗。

4、因此，开发能够对gprc5d表达的细胞发挥临床有效的细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制效应，对gprc5d不表达的细胞无不良影响的抗体，对研发gprc5d表达相关的免疫治疗产品，有非常重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种靶向gprc5d的抗体及其应用。所述抗体特异性良好且亲和力较强，为后续开发gprc5d car-t产品或者抗体药奠定了基础。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种靶向gprc5d的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述轻链可变区包括lcdr1、lcdr2和lcdr3；

4、其中，lcdr1的氨基酸序列为eniysy；lcdr2的氨基酸序列为nak；lcdr3的氨基酸序列为qhhygtpyt；hcdr1的氨基酸序列为gftfssyg；hcdr2的氨基酸序列为isnrgtyi；hcdr3的氨基酸序列为arprqigifdy；

5、或，lcdr1的氨基酸序列为qsllnsgnqkny；lcdr2的氨基酸序列为gas；lcdr3的氨基酸序列为qqhystpyt；hcdr1的氨基酸序列为gftfssyg；hcdr2的氨基酸序列为isnrgtyi；hcdr3的氨基酸序列为arprqigifdy。

6、优选地，所述重链可变区包含seq id no:15或seq id no:21所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

7、优选地，所述轻链可变区包含seq id no:16或seq id no:22所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

8、优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:15所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示；

9、或，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:21所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:22所示。

10、优选地，所述抗体为单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如seq id no:14或seqid no:20所示。

11、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的靶向gprc5d的抗体或其抗原结合片段。

12、优选地，编码所述抗体的重链可变区的核酸分子如seq id no:12所示，编码所述抗体的轻链可变区的核酸分子如seq id no:13所示；

13、或，编码所述抗体的重链可变区的核酸分子如seq id no:18所示；编码所述抗体的轻链可变区的核酸分子如seq id no:19所示。

14、优选地，编码所述单链抗体的核酸分子如seq id no:11或seq id no:17所示。

15、第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。

16、在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第二方面所述的核酸分子或上述的表达载体。

17、优选地，所述宿主细胞包括细菌、真菌或哺乳动物细胞。

18、第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的靶向gprc5d的抗体或其抗原结合片段，或者第三方面所述的表达载体，以及药学上可接受的载体。

19、第五方面，本发明提供一种用于检测gprc5d的试剂，所述试剂包括第一方面所述的靶向gprc5d的抗体或其抗原结合片段，或者第三方面所述的表达载体。

20、第六方面，本发明提供第一方面所述的靶向gprc5d的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的药物组合物或第五方面所述的用于检测gprc5d的试剂在制备治疗或检测肿瘤的药物中的应用。

21、优选地，所述肿瘤包括gprc5d表达为阳性的肿瘤；

22、优选地，所述gprc5d表达为阳性的肿瘤为多发性骨髓瘤。

23、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

24、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

25、（1）本发明中所述靶向gprc5d的抗体特异性强，具有种属交叉性反应，与细胞系不结合，与无关蛋白不结合。

26、（2）本发明获得了一种抗体，以高亲和力特异性结合gprc5d，并且能够阻断gprc5d与其受体的结合，与异源抗体相比具有更低的免疫原性；在抗体药物（包括单抗、双抗、adc等）及细胞治疗药物（包括car-t、car-nk等）的开发上有很好的应用潜力；另外所述全人源的抗体也可以用于检测试剂的开发。

27、（3）本发明使用了蛋白淘选的方法，能高效的富集结合重组gprc5d蛋白的抗体，大大降低了后期抗体筛选的难度，提高了效率。