一种抗人PLA2R的抗体及其抗原结合片段及其应用

本发明涉及抗体，具体而言，涉及一种抗人pla2r的抗体及其抗原结合片段及其应用。

背景技术：

1、膜性肾病（membranous nephropathy, mn）即膜性肾小球肾炎，具体是指免疫复合物在肾小球毛细血管中过度沉积导致的肾病综合征，是成人肾病综合征中最常见的病理类型之一。临床上mn主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿及高脂血症。

2、根据病因的不同，mn可分为特发性膜性肾病(idiopathic membranousnephropathy, imn)与继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy, smn)。其中，imn是mn的主要类型，占比约70%～80%，其病因尚不明确，又名原发性膜性肾病（primarymembranous nephropathy, pmn）。大多数学者认为pmn是一种抗体介导的自身免疫性肾小球疾病，位于足细胞的靶抗原被自身抗体识别，并与之结合形成免疫复合物沉积于基底膜足细胞下，激活补体系统引起足细胞损伤脱落，导致基底膜通透性增加，进而出现大量蛋白尿。

3、2009年beck等首次报道磷脂酶a2受体(phospholipase a2 receptor, pla2r)是导致pmn发生的主要抗原之一，在70%的pmn患者血液和肾组织洗脱液中可检测出抗磷脂酶a2受体抗体(phospholipase-a2 receptor antibody, pla2r-ab)，这引起了医学界对pla2r的广泛关注。pla2r-ab能够特异性地与肾脏组织中足细胞上的靶抗原(即pla2r)结合，可在70%～80%的pmn患者血清中表达(bobart sa, de vriese as, pawar as, et al.kidney int. 2019; 95(2): 429-438)，而在健康人群、smn及其他肾小球疾病患者的血清中pla2r-ab抗体阳性表达率极低，故pla2r-ab诊断mn的特异性较高。最新的一项meta分析显示(练明建, 卢榕, 张加勤, 等. 临床检验杂志, 2017, 35 (7)：545-549)，血清pla2r-ab检测对诊断pmn的总敏感度为69%，总特异度为97%，进一步说明血清pla2r-ab对pmn有较好的敏感性和很高的特异性，可以作为诊断pmn的特异性生物标志物。

4、pla2r由多个结构域构成（图1），研究显示导致pla2r-ab产生的结构域主要包括cysr, fnii, ctld1这三个结构域（liyo kao, vinson lam, et al. j am soc nephrol.2015 feb; 26(2): 291-301）。因此，靶向这三个结构域的单克隆抗体对于pla2r型膜性肾病的细胞及动物模型建立、机制研究、诊断以及药物开发具有重要意义。然而，目前没有商品化小鼠单克隆抗体可靶向这三个结构域。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗人pla2r的抗体及其抗原结合片段以解决上述技术问题。本发明提供的抗人pla2r单克隆抗体可靶向pla2r 的包含cysr、fnii、ctld1这三个结构域的片段，可应用于免疫组织化学(ihc)、间接elisa、免疫印记(western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域。本发明还提供了编码抗人pla2r抗体及其抗原结合片段的核酸分子、重组载体及该抗体在pla2r蛋白检测方法或产品中的应用。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种抗人pla2r的抗体及其抗原结合片段，其包括重链互补决定区和轻链互补决定区；

4、重链互补决定区包括氨基酸序列分别为seq id no.3-5所示的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；

5、轻链互补决定区包括氨基酸序列为seq id no.6所示的cdr-l1、氨基酸序列为was的cdr-l2和氨基酸序列为seq id no.7所示的cdr-l3。

6、cdr-h1的氨基酸序列seq id no.3为gysftgyy；

7、cdr-h2的氨基酸序列seq id no.4为fnpyngat；

8、cdr-h3的氨基酸序列seq id no.5为akegpyygnygyfdy；

9、cdr-l1的氨基酸序列seq id no.6为qsllnsrtrkny；

10、cdr-l2的氨基酸序列为was；

11、cdr-l3的氨基酸序列seq id no.7为kqsynlyt。

12、经过筛选，发现具有特定重链互补决定区和轻链互补决定区的抗体及其抗原结合片段与pla2r具有较高的亲和力，可以特异性结合pla2r蛋白，且能靶向pla2r 的包含cysr、fnii、ctld1这三个结构域的片段。因此，可应用于免疫组织化学(ihc)、间接elisa、免疫印记(western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域；也可用于开发膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品。

13、本发明中，“pla2r”，“磷脂酶a2受体”均为指代相同的含义。

14、在本发明应用较佳的实施方式中，抗体及其抗原结合片段还包括重链骨架区和/或轻链骨架区，重链骨架区包括依次如seq id no.17-20所示的fr-vh1、fr-vh2、fr-vh3和fr-vh4；和/或；轻链骨架区包括依次如seq id no.21-24所示的fr-vl1、fr-vl2、fr-vl3和fr-vl4。

15、其重链可变区+重链骨架区的结构为：

16、fr-vh1-cdr1-fr-vh2-cdr2-fr-vh3-cdr3-fr-vh4。

17、其轻链可变区+轻链骨架区的结构为：

18、fr-vl1-cdr1-fr-vl2-cdr2-fr-vl3-cdr3-fr-vl4。

19、在本发明应用较佳的实施方式中，抗原结合片段选自抗体的fab’、fab、f(ab’)2、scfv和fv中的任意一种。

20、上述抗原结合片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性，选自抗体的f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法（包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的抗原结合片段。

21、上述抗体或抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如applied biosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

22、在本发明应用较佳的实施方式中，抗体选自多特异性抗体、融合型抗体和嵌合抗体中的至少一种。在其他实施方式中，上述抗体选自一种单克隆抗体。

23、名词解释：

24、多特异性抗体是识别不同表位的单克隆抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单独的一种单克隆抗体具有更高的抗原识别能力。

25、融合型抗体：本发明提供的抗体或其抗原结合片段很容易通过基因工程技术与其他结构（如bsa、igg-fc等）结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，抗体与其靶抗原定向结合，与抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将抗体和寿命较长的分子融合在一起，可以提高抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。

26、本发明所述的“嵌合抗体”包括不限于将人源性抗体的可变区与人抗体（或其他来源的抗体）的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。在其他实施方式，也可根据需要将不同来源或不同类型的恒定区进行自适应重组或优化。

27、在本发明应用较佳的实施方式中，抗体或其抗原结合片段还包括恒定区，恒定区的包括轻链恒定区和重链恒定区，轻链恒定区的类型为κ型或λ型轻链恒定区；重链恒定区的类型为igm、igd、igg、iga或ige重链恒定区。

28、igg选自igg1、igg2、igg3、igg4中的任意一者的重链恒定区。

29、在本发明应用较佳的实施方式中，抗体的恒定区的种属来源为人、小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。

30、在本发明应用较佳的实施方式中，轻链恒定区和重链恒定区的氨基酸序列分别为seq id no.25和seq id no.26所示。

31、进一步地，上述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示。

32、第二方面，本发明还提供了抗人pla2r的抗体或其抗原结合片段在制备pla2r检测产品中的应用；

33、pla2r检测产品选自试剂、试剂盒或芯片；

34、检测产品包括抗体或其抗原结合片段，且抗体或其抗原结合片段标记有可被检测的标记物。

35、在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒包括载体，且载体带有抗体或其抗原结合片段；在本发明应用较佳的实施方式中，载体为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球或多孔材料。

36、载体与抗体的连接方式为偶联和/或物理连接。物理连接包括不限于静电吸附等。

37、在其他实施方式中，多孔材料选自elisa板或其他的固相支持物。

38、例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。例如将琼脂糖凝胶微球或硅胶微球上偶联抗体，制得相应的免疫亲和吸附材料。

39、在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

40、磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、peg修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、二氧化硅磁性微球。

41、乳胶微球是由无定形聚合物（通常是聚苯乙烯）形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5µm的颗粒，或者粒径超过1µm的颗粒。

42、乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。

43、在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括缓冲液、阳性对照、清洗液。

44、在本发明应用较佳的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。

45、荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物（例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素（fam）、四氯光素（tet）等或其类似物）、罗丹明类染料及其衍生物（例如包括但不限于红色罗丹明（rbitc）、四甲基罗丹明（tamra）、罗丹明b（tritc）等或其类似物）、cy系列染料及其衍生物（例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物）、alexa系列染料及其衍生物（例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物）和蛋白类染料及其衍生物（例如包括但不限于藻红蛋白（pe）、藻蓝蛋白（pc）、别藻蓝蛋白（apc）、多甲藻黄素-叶绿素蛋白（precp）等）。

46、在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

47、在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212bi、131i、111in、90y、186re、211at、125i、188re、153sm、213bi、32p、94mtc、99mtc、203pb、67ga、68ga、43sc、47sc、110min、97ru、62cu、64cu、67cu、68cu、86y、88y、121sn、161tb、166ho、105rh、177lu、172lu和18f。

48、在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种。

49、胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

50、在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

51、第三方面，本发明还提供了抗人pla2r的抗体或其抗原结合片段在制备膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品中的应用，膜性肾病的检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测的标志物为pla2r；

52、膜性肾病为原发性膜性肾病或继发性膜性肾病。

53、通过检测目标样本的血液或血清pla2r的水平，可以诊断目标样本是否患有膜性肾病或评估膜性肾病风险，也可为膜性肾病的不良预后提供参考。

54、此外，pla2r变化也可了解患者病情进展状态。治疗后病人血液中pla2r浓度的下降预示着治疗的成功，而浓度上升提示膜性肾病的残留或复发。因此，本发明提供的抗pla2r的抗体可以用于膜性肾病的疗效评估或复发监测。

55、膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品选自试剂、试剂盒或芯片；

56、膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品包括抗体或其抗原结合片段，且抗体或其抗原结合片段标记有可被检测的标记物。

57、在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒包括载体，且载体带有抗体或其抗原结合片段；在本发明应用较佳的实施方式中，载体为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球或多孔材料。

58、载体与抗体的连接方式为偶联和/或物理连接。物理连接包括不限于静电吸附等。

59、在其他实施方式中，多孔材料选自elisa板或其他的固相支持物。

60、例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。例如将琼脂糖凝胶微球或硅胶微球上偶联抗体，制得相应的免疫亲和吸附材料。

61、在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

62、磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、peg修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、二氧化硅磁性微球。

63、乳胶微球是由无定形聚合物（通常是聚苯乙烯）形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5µm的颗粒，或者粒径超过1µm的颗粒。

64、乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。

65、在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括缓冲液、阳性对照、清洗液。

66、在本发明应用较佳的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。

67、第四方面，本发明还提供了一种检测试剂或试剂盒，其包括抗人pla2r的抗体或其抗原结合片段。

68、第五方面，本发明还提供了含有抗人pla2r的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

69、免疫偶联缀合物例如选自抗体-药物缀合物，将抗体与具有特定接头的药物进行反应制得相应的抗体-药物缀合物。本领域的技术人员可以根据工程化抗体使得抗体上的某个位点作为药物缀合位点，这均在本发明的保护范围内。

70、双特异性分子例如选自双特异性抗体。

71、嵌和抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。

72、第六方面，本发明还提供了一种载体，其包括核酸分子，核酸分子编码上述的抗人pla2r的抗体或其抗原结合片段。

73、核酸分子包括如seq id no .8所示的dna序列，用于编码抗人pla2r抗体的重链；以及如seq id no .9所示的dna序列用于编码抗人pla2r抗体的轻链。

74、考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

75、载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的dna片段直接或间接（如包装成病毒）导入宿主细胞内，进行目的基因表达。

76、其中一种类型的载体是质粒，即环状双链dna分子，可将目的dna片段连接至质粒环中。

77、第七方面，本发明还提供了一种重组细胞，其包括上述的载体。

78、哺乳动物细胞选自293细胞、293t细胞、293ft细胞、cho细胞、cos细胞、小鼠l细胞、lncap细胞、633细胞、vero、bhk细胞、cv1细胞、hela细胞、mdck细胞、hep-2细胞和per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、per6细胞和cho细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。

79、第八方面，本发明还提供了一种抗人pla2r的抗体或其抗原结合片段在检测表达pla2r的细胞模型中人pla2r水平或药物活性检测中的用途，用途以非诊断和治疗为目的。

80、药物活性检测包括构建稳定表达人pla2r或表达包含cysr、fnii、ctld1这三个结构域的膜蛋白的细胞，以抗人pla2r抗体引发抗体诱导的细胞杀伤作用（包括cdc、adcc、adcp）以建立细胞损伤模型，检测药物对这一杀伤作用的抑制，以此作为定量活性检测以及药物质量控制的方法。本发明提供的抗人pla2r抗体可有两方面的用途，一是确定稳定表达人pla2r或表达包含cysr、fnii、ctld1这三个结构域的膜蛋白的细胞成功建立，并检测表达水平。二是引发抗体诱导的细胞杀伤作用以建立损伤模型。

81、本发明具有以下有益效果：

82、经过筛选，发现具有特定重链互补决定区和轻链互补决定区的抗体及其抗原结合片段与pla2r具有较高的亲和力，可以特异性结合pla2r蛋白，且能靶向pla2r 的包含cysr、fnii、ctld1这三个结构域的片段。因此，可应用于免疫组织化学(ihc)、间接elisa、免疫印记(western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域；也可用于开发膜性肾病检测、诊断、预后、疗效评估或复发监测产品。