一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法与流程

本发明微生物培养，尤其涉及一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法。

背景技术：

1、在自然界中，共生关系普遍存在于大多数的生物中。典型的共生关系由微生物和植物二者形成特定的组织形态，包括细菌与植物的共生关系和真菌与植物的共生关系。而兰科植物属被子植物们，是有花植物中最大的科，几乎所有的兰科植物都与真菌共生，兰科菌根共生关系几乎伴随着兰科植物从种子萌发到开花结果的整个过程，且大多数成年的兰科植物任然需要菌根真菌提供生长所需的碳水化合物及有机质。

2、寒兰作为兰科植物的一大品种，具有很大的观赏价值，但是由于其生存环境的破坏、过度的采挖和林木的砍伐等原因导致其种群数量和分布区域都在相应的缩减。而菌根共生真菌对寒兰在生长发育和抵抗外界胁迫等方面具有增益的作用，因此筛选出野生寒兰菌根共生真菌，在利用其促进寒兰的生长发育，对寒兰的资源保护具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于公开一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，能够有效筛选得到野生寒兰菌根共生菌，能够为寒兰的生长研究提供新的理论基础。

2、具体的，本发明的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，具体包括以下步骤：

3、s1：收集野生寒兰作为样品，然后用自来水冲洗干净后，进行消毒除菌处理；

4、s2：在无菌研钵中加入无菌水，取经过消毒处理的寒兰样品的根，充分研磨得到组织液；

5、s3：用移液枪吸取组织液滴于萌发培养基上，每隔3d观察1次，待萌发培养基上长出菌丝后，及时挑取形态不同的菌丝或菌落转移至pda培养基上进行纯化培养，纯化后的菌株于4℃温度下保存备用。

6、进一步，所述s1步骤中，在收集野生寒兰时，将原地的腐殖质及土壤等一起收集。

7、进一步，所述消毒除菌处理具体为：在超净工作台上，先用75％乙醇浸泡处理30-60s，然后用无菌水冲洗4-5次，再用1％次氯酸钠浸泡灭菌4-5min，用无菌水冲洗3-5次，用无菌滤纸吸干水分，备用。

8、进一步，所述s3步骤得到的菌株进行检测，检测得到共生真菌包括青霉属桔青霉，棘阿米巴属真菌。

9、进一步，所述萌发培养基包括以下重量份原料：马铃薯180-200份、甘油40-50份、葡萄糖15-25份、琼脂20-25份、硫酸镁1-2份、改性螺旋藻粉末80-100份。

10、进一步，所述萌发培养基包括以下重量份原料：马铃薯200份、甘油45份、葡萄糖20份、琼脂20份、硫酸镁1份、改性螺旋藻粉末90份。

11、进一步，所述改性螺旋藻粉末的制备方法为：取螺旋藻粉末加水调成糊状进行冻融处理3-4次，然后加热升温至50-55℃，加入蛋白酶溶液，保温反应36-48h，加热后过滤，得到滤液和滤渣，向滤渣中加入山梨醇和聚乙二醇200，在110-120℃温度下加压压缩得到胚体，将胚体冷却后碾磨成粉，在空气氛围下先于200-220℃煅烧1-2h，再升温至300-350℃进行半碳化30-45min，随炉冷却后取出，得到基体，将制备得到基体浸入滤液中，浸泡1-2d，取出干燥得到改性螺旋藻粉末。

12、进一步，所述萌发培养基的制备方法具体为：将马铃薯去皮切块，加水煮沸30min，纱布过滤得到滤液，在滤液中加入葡萄糖、硫酸镁搅拌溶化后，加入甘油和改性螺旋藻粉末，持续搅拌分散均匀，加入琼脂混匀后进行灭菌，得到萌发培养基。

13、本发明的有益效果：

14、1、本发明公开了一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，能够有效筛选得到野生寒兰菌根共生菌，能够为寒兰的生长研究提供新的理论基础。

15、2、本发明的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，在对野生寒兰菌根共生真菌进行培养时，对萌发培养基进行改进，添加改性螺旋藻粉末作为氮源，有机的氮源能够更好的为真菌提供营养物质，有利于真菌的培养。

16、3、本申请的改性螺旋藻粉末，先将螺旋藻进行酶解提取，能够将螺旋藻内的营养物质释放出来，更好的进行利用，然后将提取剩下的固体物质经过加压压缩，在山梨醇的作用下，螺旋藻细胞进行粘合，形成胚体，经过煅烧，添加的聚乙二醇200发生分解在胚体上形成多孔的结构，能够负载更多的提取液，也为真菌的附着提供更好的环境。

技术特征：

1.一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，其特征在于，所述s1步骤中，在收集野生寒兰时，将原地的腐殖质及土壤等一起收集。

3.根据权利要求2所述的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，其特征在于，所述消毒除菌处理具体为：在超净工作台上，先用75％乙醇浸泡处理30-60s，然后用无菌水冲洗4-5次，再用1％次氯酸钠浸泡灭菌4-5min，用无菌水冲洗3-5次，用无菌滤纸吸干水分，备用。

4.根据权利要求3所述的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，其特征在于，所述s3步骤得到的菌株进行检测，检测得到共生真菌包括青霉属桔青霉，棘阿米巴属真菌。

5.根据权利要求4所述的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，其特征在于，所述萌发培养基包括以下重量份原料：马铃薯180-200份、甘油40-50份、葡萄糖15-25份、琼脂20-25份、硫酸镁1-2份、改性螺旋藻粉末80-100份。

6.根据权利要求5所述的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，其特征在于，所述萌发培养基包括以下重量份原料：马铃薯200份、甘油45份、葡萄糖20份、琼脂20份、硫酸镁1份、改性螺旋藻粉末90份。

7.根据权利要求6所述的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，其特征在于，所述改性螺旋藻粉末的制备方法为：取螺旋藻粉末加水调成糊状进行冻融处理3-4次，然后加热升温至50-55℃，加入蛋白酶溶液，保温反应36-48h，加热后过滤，得到滤液和滤渣，向滤渣中加入山梨醇和聚乙二醇200，在110-120℃温度下加压压缩得到胚体，将胚体冷却后碾磨成粉，在空气氛围下先于200-220℃煅烧1-2h，再升温至300-350℃进行半碳化30-45min，随炉冷却后取出，得到基体，将制备得到基体浸入滤液中，浸泡1-2d，取出干燥得到改性螺旋藻粉末。

8.根据权利要求7所述的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，其特征在于，所述萌发培养基的制备方法具体为：将马铃薯去皮切块，加水煮沸30min，纱布过滤得到滤液，在滤液中加入葡萄糖、硫酸镁搅拌溶化后，加入甘油和改性螺旋藻粉末，持续搅拌分散均匀，加入琼脂混匀后进行灭菌，得到萌发培养基。

技术总结
本发明公开了一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法，涉及微生物培养技术领域。具体包括以下步骤：收集野生寒兰作为样品，然后用自来水冲洗干净后，进行消毒除菌处理；在无菌研钵中加入无菌水，取经过消毒处理的寒兰样品的根，充分研磨得到组织液；用移液枪吸取组织液滴于萌发培养基上，每隔3d观察1次，待萌发培养基上长出菌丝后，及时挑取形态不同的菌丝或菌落转移至PDA培养基上进行纯化培养，纯化后的菌株于4℃温度下保存备用。本发明的一种筛选获得野生寒兰菌根共生真菌的方法能够有效筛选得到野生寒兰菌根共生菌，能够为寒兰的生长研究提供新的理论基础。

技术研发人员：胡瑶,李丽辉,雷星宇,张跃龙,李宏告
受保护的技术使用者：湖南省核农学与航天育种研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16