引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用的制作方法

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种猪的急性、高度接触性传染病。一旦出现发病，病程短发病快，表现为皮肤发绀、高热、严重出血等症状，病死率接近100％。

2、2018年8月，非洲猪瘟病毒首次传入我国，随后快速蔓延，给我国养猪业带来巨大损失。asfv是囊膜双链dna病毒，通过虫媒传播，基因组170～193kbp，编码多种结构蛋白和非结构蛋白。由于病毒结构的多样、强抵抗力及复杂免疫逃避机制，使得临床对非洲猪瘟的防控非常困难，目前国内也还未研发出安全、有效的商品化疫苗及药物。临床只能通过快速检测鉴别及快速剔除阳性猪只进行有效的防控。

3、目前临床上对非洲猪瘟的检测方法有：常规pcr、荧光定量pcr、elisa等，各类检测方法检测效果对比中，荧光定量pcr相比其他检测方法，灵敏度高、特异性强、检测周期短等优点，目前是临床上对非洲猪瘟最普及的检测方法。

4、2022年，首个asfv i177l商品化缺失疫苗在越南首次批准上市。但依照目前研究表明，该弱毒疫苗在生物安全方面还存在水平传播的风险，随着感染代次的增加，病毒还能保持较高病毒滴度，市面该疫苗的批注使用引起的传播风险可能会给生猪养殖产业的生物安全带来较大的威胁，对临床非洲猪瘟病毒的防控带来一定的挑战。

5、目前，asfv i177l基因缺失株是在野生型毒株基础上缺失了i177l基因，为防控asfv i177l基因缺失疫苗在我国的传播，建立一种快速、有效鉴别该基因缺失毒株的检测方法迫在眉睫。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。本发明所采用的asfv 177病毒荧光定量pcr方法相比于普通pcr检测方法，具有操作简便，特异性强，敏感度高，重复性好等优点，对asfv 177病毒的临床检测具有重要的现实意义。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了引物组，所述引物组具有：

4、(1)、如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列；或

5、(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

6、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

7、(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

8、本发明还提供了探针，所述探针具有：

9、(5)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或

10、(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

11、(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

12、(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

13、在本发明的一些实施方案中，上述探针的核苷酸序列的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。

14、在本发明的一些实施方案中，上述探针中，所述荧光报告基团为fam，所述淬灭基团为bhq1。

15、本发明还提供了检测试剂，包括上述引物组和/或上述探针以及可接受的助剂。

16、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂，还包括：taq master mix、阳性标准质粒、阳性标准质粒的引物组和模板；

17、所述阳性标准质粒的引物组具有如seq id no:4和seq id no:5所示的序列。

18、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述探针的浓度为10μm，所述引物组的浓度为10μm。

19、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，上游引物的浓度为10μm，下游引物的浓度为10μm。

20、本发明还提供了检测试剂盒，包括上述检测试剂以及可接受的载体或装置。

21、本发明还提供了上述引物组、上述探针、上述检测试剂和/或上述检测试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。

22、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒i177l基因缺失病毒。

23、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述检测包括如下步骤：获得所述样品的cdna与上述检测试剂和/或上述检测试剂盒混合，扩增，根据cq值和扩增曲线，获得所述样品是否为阳性。

24、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述扩增的程序包括：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃退火30s。

25、本发明的一些实施方案中，上述应用中所述扩增的体系包括：

26、

27、本发明提供了引物组，所述引物组具有：

28、(1)、如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列；或

29、(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

30、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

31、(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

32、本发明的有益效果包括：

33、(1)、操作简单：本发明不需电泳、显色等过程，自动化程度高，一步实现扩增和检测。

34、(2)、特异性强：本发明能够特异性检测出非洲猪瘟病毒i177l基因缺失病毒，对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒等毒株的检测结果均为阴性，具有很好的特异性。

35、(3)、敏感性高：荧光检测技术是极其灵敏的检测技术，本发明用于非洲猪瘟病毒i177l基因缺失病毒的检测，其最低检测限为3.43×101copies/μl。

36、(4)、准确性高：本发明所使用的引物是针对非洲猪瘟病毒i177l基因设计，能真实、准确地反应出非洲猪瘟病毒i177l基因缺失病毒含量。

37、(5)、本发明对产物可以实现定量：由于荧光信号的强弱和扩增产物量成线性对应关系，通过收集荧光信号可以实现产物的定量。

38、(6)、本发明具有操作简单，灵敏度高，特异性强，准确快速等特点，有利于在临床实践中推广应用。