抗人PD-1鼠单抗及其制备方法和应用与流程

本发明属于抗体领域，具体涉及抗人pd-1鼠单抗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、程序性死亡受体-1(programmed death-1，pd-1)，作为免疫球蛋白超家族中的一员，是一个重要的负性共刺激分子。研究表明，pd-1通过向下调节免疫系统对人体细胞的反应，以及通过抑制t细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受，在调节t细胞衰竭中起核心作用。在正常的情况下，pd-1/pd-l1免疫检查点的激活可以通过抑制t细胞活化而避免自身免疫性疾病的发生，然而，肿瘤细胞表面的pd-l1能够与肿瘤浸润t细胞表面的pd-1结合，抑制t细胞的活化，导致t细胞无法识别肿瘤细胞，进而使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视和杀伤。pd-1不仅在t细胞上表达，还在nk细胞、b淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞上表达。

2、pd-1与其配体pd-l1、pd-l2相结合，发挥负性调控作用，参与维持机体免疫稳态。pd-1/pd-ls是维持机体免疫平衡的重要机制，也是移植免疫、炎症、自身免疫性疾病(i型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)、免疫缺陷性疾病(反复肺部肠腔感染等)、神经系统疾病(缺血性脑卒中、多发性硬化症、阿尔茨海默症等)、慢性病毒感染疾病(肺结核、乙型肝炎等)、肿瘤(非小细胞肺癌、霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤等)等疾病病理过程研究、诊断和治疗的重要靶点[1-3]。

3、pd-1单克隆抗体作为免疫抑制剂，相比于甾体类激素等常规免疫抑制药物，因其应答之广度、深度、持久性、毒副作用小等优点，成为了近年研究的一大热点。目前pd-1单克隆抗体在临床，尤其是在肿瘤自身免疫性疾病治疗中的作用正得到越来越多的关注，已经获得了初步的进展。抗pd-1单克隆抗体的独特性和众多优点将使之成为治疗自身免疫性疾病更好的手段和方法。

4、杂交瘤制备技术不仅在生物学和免疫学基础研究中具有重要的价值，而且在实践中的应用范围亦极为广泛。然而在利用杂交瘤制备技术制备抗体时，由于杂交瘤不稳定，抗体基因容易丢失，并且传统的杂交瘤制备技术不会对目标抗体的基因序列及蛋白序列进行鉴定，不利于对目标抗体后续的生产、制备及研发工作。基因工程方法可以很好地解决杂交瘤方法中的问题，并且通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应，基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位。然而通过基因工程方法进行抗体的制备必需的条件是明确抗体的序列，因此，挖掘更适用于pd-1检测的单克隆抗体是当前更为合适的研发方向。

5、[1]kuol n,stojanovska l,nurgali k,apostolopoulos v.pd-1/pd-l1 indisease.immunotherapy[j].2018 feb；10(2):149-160.

6、[2]ghosh c,luong g,sun y.a snapshot of the pd-1/pd-l1 pathway[j].cancer.2021 mar 5；12(9):2735-2746.

7、[3]郑小翠.鼠抗人pd-1单克隆抗体研制及其生物学功能鉴定[d].苏州大学,2018.

技术实现思路

1、针对上述不足，本发明提供了两种新的抗人pd-1鼠单抗，并通过设计基因与蛋白序列，建立该基因的稳转cho细胞株进行重组表达，经验证，表达纯化的抗体能够特异性识别人pd-1抗原，抗体表达产量达到g/l级别，远远高于传统的杂交瘤细胞制备抗体的产量。

2、术语：

3、本发明中，氨基酸包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名法委员会所推荐的单字母符号来提及。

4、本发明中，互补决定区，本文中又称cdr。本文中公开的互补决定区指抗体的重链或轻链可变区内的抗原结合点，即抗体中引起抗原结合的氨基酸残基。轻链和重链的互补决定区共同组成抗体的抗原结合部位。通常而言，抗体的轻链或重链的通常包含3个决定簇互补区。本文中的互补决定区指重链的互补决定区时，简称为hcdr，并以数字指代3个不同的互补决定区，例如hcdr1、hcdr2、hcdr3。本文中的互补决定区指轻链的互补决定区时，简称为lcdr，并以数字指代3个不同的互补决定区，例如lcdr1、lcdr2、lcdr3。

5、本发明中，可变区指免疫球蛋白轻链和重链靠近n端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。

6、本发明中，重链指抗体中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(h链)；轻链指抗体中2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(l链)。

7、本发明中，相似性指同源蛋白质的氨基酸序列中一致性和可取代氨基酸所占的比例。

8、本发明中，单克隆抗体指由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。

9、本发明中，鼠源化抗体指将来源于免疫接种过的小鼠的b细胞与骨髓瘤细胞融合，得到的鼠杂交融合细胞分泌的抗体。

10、本发明中，自制鼠抗人pd-1抗体[zxclonehpd1-03]；自制鼠抗人pd-1抗体[zxclonehpd1-04]，二者均为抗人pd-1鼠抗由cho稳转的细胞株生产的重组蛋白，并非由单克隆的杂交瘤细胞进行生产。

11、一方面，本发明提供了一种抗人pd-1抗体。

12、所述的抗人pd-1抗体包括重链和轻链，所述的重链包括重链互补决定区，所述的轻链包括轻链互补决定区，其中：

13、所述的抗体重链互补决定区包括如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；所述抗体的轻链可变区包括如seq id no：4、seq id no：5和seqid no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

14、或者，所述的抗体重链互补决定区包括如seq id no：7、seq id no：8和seq idno：9所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；所述抗体的轻链可变区包括如seq id no：10、seq idno：11和seq id no：12所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。

15、具体地，所述的抗pd-1抗体重链可变区氨基酸序列为seq id no：13，轻链可变区氨基酸序列为seq id no：14；或所述的抗pd-1抗体的重链可变区氨基酸序列为seq id no：15，轻链可变区氨基酸序列为seq id no：16。

16、具体地，所述的抗pd-1抗体为单克隆抗体。

17、优选地，所述的抗pd-1抗体为鼠源化抗体。

18、具体地，所述的抗pd-1抗体的重链氨基酸序列为seq id no：17，轻链氨基酸序列为seq id no：18；或所述的抗pd-1抗体的重链氨基酸序列为seq id no：19，轻链氨基酸序列为seq id no：20。

19、另一方面，本发明提供了表达前述的抗人pd-1抗体的核苷酸。

20、所述的核苷酸可以是通过密码子简并性优化后的序列，用于编码前述的抗pd-1抗体均可。

21、优选地，重链seq id no：17对应的核苷酸序列为seq id no.21所示，轻链氨基酸序列为seq id no：18对应的核苷酸序列为seq id no.22所示；重链seq id no：19对应的核苷酸序列为seq id no.23所示，轻链seq id no：20对应的核苷酸序列为seq id no.24所示。

22、再一方面，本发明提供了包括前述的核苷酸序列的表达载体。

23、所述的表达载体可以包括但不限于质粒、噬菌体、病毒。

24、又一方面，本发明提供了表达前述的抗人pd-1抗体或核苷酸序列或表达载体的细胞。

25、所述的细胞的作用在于可以高效表达抗人pd-1抗体。

26、具体地，所述的细胞包括但不限于hek293或cho。

27、又一方面，本发明提供了制备前述的抗人pd-1抗体的方法，所述的方法中包括培养前述的细胞。

28、所述的方法中还可能包括抗体纯化步骤。

29、所述的抗体纯化步骤包括但不限于沉淀法、广谱亲和纯化、抗原特异性纯化、离子交换法。

30、又一方面，本发明提供了对前述的抗人pd-1抗体进行荧光标记的方法，所述的方法中包括使用大分子染料对抗人pd-1抗体进行标记。

31、优选地，所述的大分子染料为pe。

32、又一方面，本发明提供了一种抗人pd-1抗体的检测方法，所述检测方法通过前述的抗pd-1抗体进行检测，

33、具体地，所述检测方法中还可以包括样品前处理步骤。

34、所述的前处理步骤为样本的采集及处理。

35、优选地，所述检测方法非疾病诊断或治疗方法。

36、又一方面，本发明提供了前述抗人pd-1抗体、核酸、表达载体和/或宿主细胞在pd-1检测中的应用。

37、具体地，所述应用通过抗体抗原结合实现。

38、具体地，所述应用为在制备药物中的应用。

39、优选地，所述应用包括但不限于在制备对抗自身免疫紊乱、移植免疫应答、慢性病毒感染、肿瘤药物中的应用。

40、本发明所取得的的技术效果：

41、本发明提供了两种新的抗人pd-1鼠单抗，并通过设计基因与蛋白序列，建立该基因的稳转cho细胞株进行重组表达，经验证，表达纯化的抗体能够特异性识别人pd-1抗原，抗体表达产量达到g/l级别，远远高于传统的杂交瘤细胞制备抗体的产量。