用于冠状病毒检测的组合物及其制备和使用方法与流程

本发明总体上属于sars-cov-2检测领域。

背景技术：

1、由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的2019年冠状病毒病(covid-19)大流行仍然是公共卫生问题(1-3)。伴随着全球确诊病例超过4.9亿，其已经是有记录以来最大规模的流行病之一(4,5)。及时诊断covid-19是大流行控制的核心支柱，因为这不仅可以指导社区和医疗机构的感染控制，还可以为高危个体的早期治疗决策提供信息(6-9)。在全球范围内，covid-19诊断主要依靠抗原检测(通常采用侧流形式)或核酸扩增检测(naat)如逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)(10)。sars-cov-2(引起2019年冠状病毒病(covid-19)的病毒)的诊断的准确检测对于及时治疗和感染控制决策非常重要。抗原检测相对便宜，并且可以用作现场检测，但对早期covid-19诊断缺乏敏感性(11,12)。相比之下，rt-pcr灵敏度很高，但需要在配备经过培训的工作人员和专业设备如热循环仪的实验室进行集中测试(13-15)。因此，rt-pcr无法在资源有限的环境中方便地大规模部署。

2、仍然需要改进检测sars-cov-2的方法和试剂，从而避免复杂的仪器和训练有素的工作人员的需求、保持高度的敏感性和特异性，并降低与检测相关的成本。此类方法将使测试复杂程度降低且更便宜，从而大大提高测试的可能性。

3、本发明的一个目的是提供用于检测和诊断sars-cov-2的组合物、方法和试剂盒。

4、本发明的另一个目的是提供用于检测和诊断sars-cov-2的组合物、方法和试剂盒，相对于现有的检测方法，其显示出改进的灵敏度和特异性以及降低的与测试相关的成本。

技术实现思路

1、提供了用于检测sars-cov-2的序列，并且可以例如包括以下或由以下组成：seqid no:4-8中任一项的序列，与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列，相对于其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸取代、添加、缺失或其组合的核酸序列，或前述任一项的反向互补物。这些序列可用于使用逆转录环介导的等温扩增(rt-lamp)来扩增样品中的sars-cov-2nsp8基因，并且优选与cas酶/sgrna对和报告核酸组合使用。报告核酸优选是在5’和3’末端用荧光团/淬灭剂对标记的ssdna或dsdna，荧光团存在于一端(5’/3’)并且淬灭剂存在于另一端(5’/3’)。

2、所公开的序列可以用于检测样品中的sars-cov-2核酸的方法，所述样品如粘液、痰(处理过的或未处理过的)、支气管肺泡灌洗液(bal)、支气管冲洗液(bw)、体液、脑脊液(csf)、尿液、组织(例如，活检材料)、直肠拭子、鼻咽抽吸物、鼻咽拭子、咽喉拭子、粪便、血浆、血清或全血，因此，也提供了检测此类样品中的sars-cov-2的方法。该样品可以是从可能已经暴露于或怀疑患有sars-cov-2的受试者中分离出来的样品。在一些实施方案中，在对样品进行检测方法之前，对样品进行处理以从样品中暴露或分离核酸。

3、还公开了用于检测样品中sars-cov-2的存在的方法。该方法使用经设计以扩增样品中保守的sars-cov-2nsp8基因的5个引物。所公开的方法包括鉴定感染有sars-cov-2的受试者和/或诊断受试者为患有covid 19。该方法是rt-lamp测定，靶向sars-cov-2nsp8基因，并且优选利用cas酶/sgrna对和报告核酸。在优选的实施方案中，该方法是一步比色rt-lamp。一般来说，sars-cov-2rna的特定基因序列(本文为nsp8)使用rt-lamp进行扩增。rt-lamp产物由cas12a-grna核糖核蛋白(rnp)复合物扫描。rnp与grna的特异性互补物结合，激活cas12a的转切割活性。活性cas12a系统切割短的(例如8nt)ssdna报告物，该报告物优选经标记，在两末端具有荧光团和淬灭剂。报告物的切割将淬灭剂与荧光团分开，从而生成肉眼可检测到的荧光。该方法包括以下步骤：

4、(a)在足以扩增sars-cov-2的nsp8基因的条件下使样品与包含要求保护的组合物的组合物接触，所述要求保护的组合物包含以下或基本上由以下组成：seq id no:4；seqid no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的核酸序列，或与前述任一项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列，和

5、(b)检测sars-cov-2nsp8基因扩增产物，从而检测样品中sars-cov-2nsp8的存在，该方法包括在步骤(b)之前将来自步骤(a)的样品与包含cas酶/sgrna对和报告核酸的组合物接触的任选步骤。

6、本文公开了用于在单个管中进行rt-lamp和crispr cas12a介导的环境可视化的测定试剂盒。试剂盒包括本文公开的组合物，包括但不限于crispr cas12a/sgrna、报告核酸，例如标记的ssdna、rt-lamp引物。

7、可以将测定试剂盒制备成包括至少一个或两个容器。容器可以包括液体试剂、冻干试剂及其组合。在其中一个容器包括干燥试剂的实施方案中，第二容器包括含有用于rt-lamp的引物和ssdna报告物的再水化缓冲溶液。

技术特征：

1.用于检测样品中sars-cov-2nsp8基因的存在的核酸组合物，所述核酸组合物包含以下或由以下组成：核酸序列seq id no:4；seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seqid no:8，或

2.权利要求2的组合物，其进一步包含(a)cas/sgrna对，和(b)一种或多种荧光报告物、一种或多种淬灭剂或其组合，(c)磷酸盐缓冲液或tris缓冲液，(d)逆转录酶和具有链置换活性的dna聚合酶，和/或(e)一种或多种去污剂。

3.权利要求1的组合物，其包含一种或多种盐。

4.权利要求3的组合物，其中所述盐是钾盐、钠盐、镁盐或铵盐。

5.权利要求4的组合物，其中所述盐选自kcl、nacl、mgcl2、mgso4、(nh4)2so4。

6.权利要求1的组合物，其包含选自datp、dctp、dgtp和dttp的一种或多种核苷酸或核苷酸类似物。

7.权利要求2的组合物，其中所述sgrna包含seq id no:1或与前述序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。

8.权利要求7的组合物，其中所述报告物包含seq id no:3，或与前述序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。

9.检测样品中sars-cov-2核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

10.权利要求9的方法，其中所述引物包含seq id no:4-8。

11.权利要求9-10中任一项的方法，其中所述引物包含与seq id no:4-8中任一项具有至少90％的序列同一性的核酸序列。

12.权利要求11的方法，其中所述样品选自粘液、痰液(处理过的或未处理过的)、支气管肺泡灌洗液(bal)、支气管冲洗液(bw)、体液、脑脊液(csf)、尿液、组织(例如活检材料)、直肠拭子、鼻咽抽吸物、鼻咽拭子、咽拭子、粪便、血浆、血清或全血，其中所述方法包括从所述样品中提取核酸并将所述样品与所述rt-lamp引物接触的步骤。

13.权利要求12的方法，其中所述样品获自鼻咽拭子、鼻咽抽吸物、痰/深喉唾液或咽拭子。

14.权利要求13的方法，其中所述rt-lamp反应条件包括约60℃的反应温度和以下引物终浓度：

15.权利要求14的方法，其中，(i)seq id no:4/seq id no:5的浓度为约0.2μm；(ii)seq id no:7的浓度为约1.6μm；和/或(iii)seq id no:8的浓度为约0.4μm。

16.权利要求14的方法，其中所述rt-lamp反应包含逆转录酶、dna聚合酶、ph指示剂和六个引物以扩增所述sars-cov-2e基因，导致ph下降和从粉红色到黄色的颜色变化，表明所述样品中存在sars-cov-2。

17.用于检测样品中sars-cov-2nsp8基因的存在的试剂盒，其包含在一个或多个容器中的权利要求1-12中任一项的组合物。

18.权利要求17的试剂盒，其中所述组合物的一种或多种组分是冻干的。

19.权利要求18的试剂盒，其包含两个容器，其中一个容器包含冻干组分，并且第二容器包含再水化溶液，所述再水化溶液包含用于rt-lamp的引物和ssdna报告物。

20.权利要求18的试剂盒，其包含在容器底部的除引物外的rt-lamp反应试剂和在所述容器的盖上的cas酶反应试剂，其中(a)所述rt-lamp反应试剂选自下组：dntp、等温扩增缓冲液、mgso4、rnase抑制剂、逆转录酶和dna聚合酶以及合适的稳定剂，如d-(+)-海藻糖二水合物、甘露醇、蔗糖；和(b)cas酶反应试剂包含用于cas12a介导的反应的rnp复合物、mgso4和tris-hcl。

技术总结
提供了用于检测SARS‑CoV‑2的序列并且包括例如SEQ ID NO:4‑8。这些序列可用于使用逆转录环介导的等温扩增(RT‑LAMP)来扩增样品中的SARS‑CoV‑2nsp8基因，并且优选与Cas酶/sgRNA对和报告核酸组合使用。所公开的序列可以用于检测样品中的SARS‑CoV‑2核酸的方法。一般来说，SARS‑CoV‑2RNA的特定基因序列(本文为nsp8)使用RT‑LAMP进行扩增。RT‑LAMP产物由Cas12a‑gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物扫描。RNP与gRNA的特异性互补物结合，激活Cas12a的转切割活性。活性Cas12a系统切割短的ssDNA报告物，该报告物优选经标记，在两末端具有荧光团和淬灭剂。报告物的切割将淬灭剂与荧光团分开，并生成肉眼可检测到的荧光。

技术研发人员：杜启泓,S·斯里达尔,袁国勇,叶植恩
受保护的技术使用者：港大科桥有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27